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Introducción

La enfermedad periodontal o periodontitis es una patología inflamatoria de los tejidos de soporte de los dientes causada por microorganismos o grupos de microorganismos específicos que producen la destrucción progresiva del ligamento periodontal y el hueso alveolar con formación de bolsa, recesión o ambas (1,2).

En los últimos años se ha reportado una relación entre los virus humanos y las bacterias periodonto-patógenas. Inclusive, se ha observado la presencia de los herpes virus humanos en bolsas periodontales compartiendo el mismo nicho con estas bacterias (3).

Investigaciones recientes documentaron un posible nexo entre la enfermedad periodontal crónica y el virus del herpes, particularmente el herpes virus tipo l y el citomegalovirus (2,4). Dichos virus se han encontrado en muestras de placa subgingival y en sitios de profundidad de bolsa mayores a cinco milímetros (5). El virus del herpes simple tipo I (HSV) presenta una menor prevalencia que el citomegalovirus (HCMV) y que el virus del Epstein-Barr (EBV). El HSV se ha asociado con la enfermedad periodontal ya que su presencia abunda en pacientes con parámetros clínicos mayormente afectados (6-9). El HCMV se ha asociado con diversas manifestaciones de la enfermedad periodontal como el índice periodontal, índice gingival, niveles clínicos de inserción, entre otros (10). Kamma y col (11) demostraron que tanto el HSV como el HCMV tienen asociación estadística con la presencia de enfermedad periodontal activa. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar la presencia del herpes virus mediante pruebas de reacción de cadena polimerasa (PCR) en paciente con enfermedad periodontal crónica y agresiva.

Materiales y métodos

Este estudio evaluó 24 pacientes que asistieron al posgrado de periodoncia de la Universidad Autónoma de Nuevo León, México El estudio fue aprobado por el comité de ética de la universidad y a cada paciente se le brindó una hoja de consentimiento informado, la cual fue voluntariamente aprobada y firmada.

Los participantes cumplieron con los siguientes criterios de inclusión: Ausencia de padecimientos sistémicos, exposición a tratamiento antibiótico en los últimos 3 meses, mujeres que no se encontraran embarazadas o en período de lactancia, ausencia de terapia periodontal por los últimos 6 meses, Pacientes no fumadores.

A cada participante se le evaluaron los parámetros clínicos de índice de placa de Quegley y Hein modificado por Turesky (12), el índice de sangrado por Löe y Silness (13), la profundidad de surco y los niveles de inserción. Los parámetros clínicos se realizaron en seis sitios de la superficie dental (mesial, medial, distal- vestibular y mesial, medial y disto-lingual) tanto para las zonas de muestreo como para los dientes control.

Recolección de la muestra y preparación

Posterior a una fase higiénica completa, se realizó la obtención de las muestras en donde se tomaron biopsias de tejido adquiridas de las piezas dentales donde se encontró la mayor profundidad de bolsa a la hora de la intervención quirúrgica. En los casos de sitios de control, se eligieron como muestras piezas de procedimientos de alargamiento de corona, donde el surco midiese igual o menor a 3mm. A cada espécimen, se le realizó la recolección de tejido de dientes adyacentes para obtener mayor cantidad de tejido a la hora de procesarlo. Las biopsias de tejido fueron colocadas en una solución buffer (ph=8).

Extracción del ácido desoxiribonucléico (ADN)

La extracción del ADN de las biopsias previamente obtenidas se realizó utilizando el Kit GENTRA® (QIAGEM, E.E.U.U). Posterior a este paso se obtuvo el ADN puro de la biopsia que fue sometido a las pruebas de reacción de la cadena polimerasa (PCR) viral.

Primers u oligos

El diseño de los oligos que se utilizaron fue dado por la casa comercial Maxim Biotech. Inc.® (San Francisco, E.E.U.U.) con la siguiente secuencia para los virus estudiados:

Preparación del ADN para la reacción en cadena de polimerasa (PCR)

La preparación se realizó siguiendo los lineamientos establecidos por los kits de la casa comercial Maxim Biotech. Inc. (San Francisco, E.E.U.U). Se prepararon 20,2 µL solución, utilizando 16 µL de la mezcla del kit conteniendo el buffer para PCR (dNTP’s, químicos, potenciador y los oligos del virus respectivo), 4 µL del ADN de la muestra y 0,2 uLde la Taq polimerasa. Cada muestra se almacenó de acuerdo a las recomendaciones del fabricante hasta su análisis.

Parámetros para la PCR

Los siguientes parámetros fueron considerados para la PCR.

Una vez edificado el gel para la electroforesis, se colocó con una pipeta tipo Eppendorf 5 µL del buffer de carga y 5 µL de cada una de las muestras con las condiciones para PCR descritas. Las condiciones para la electroforesis se realizaron en una cubeta de electroforesis a un voltaje de 80 voltios durante una hora, para finalizar con su interpretación. Para las pruebas que resultaran negativas para virus se realizó una prueba de electroforesis con controles endógenos a base de actina, para descartar la posibilidad de una mala obtención del ADN de la muestra.

Resultados

Las características de la población que se estudió se muestran en la tabla 1.

La prevalencia de la enfermedad periodontal crónica fue mayor en mujeres que en hombres. El índice gingival muestra un promedio de 1.86 que implica una inflamación de tipo leve y el índice de placa fue de 2.4, correspondiente a presencia de placa en el tercio apical.

La distribución del diagnóstico periodontal se muestra en la tabla 2. La mayor distribución se encontró para la periodontitis crónica generalizada en un 42%, y los pacientes con periodontitis agresiva se presentaron en un 25% distribuido en un 12.5 % para pacientes con periodontitis agresiva localizada y el mismo porcentaje para pacientes con periodontitis agresiva generalizada. Se realizaron amplificaciones del gen de actina como control endógeno y se demostró la amplificación de ADN.

La evaluación de la presencia de los virus estudiados, herpes simple tipo 1, herpes simple tipo 2 y citomegalovirus en los grupos de periodontitis crónica, periodontitis agresiva y el grupo control, resultó negativa en este estudio.

Discusión

Este estudio evaluó la presencia de los herpes virus tipo 1, 2 y citomegalovirus en pacientes con enfermedad periodontal crónica, enfermedad periodontal agresiva y pacientes control. Al igual que muchos estudios, esta investigación utilizó pruebas sensibles de PCR para la detección de los virus estudiados (14,15, 16). La progresión de la periodontitis está asociada con los aumentos en los niveles de ciertas bacterias principalmente de tipo anaeróbicas, y mas recientemente se ha asociado la presencia de ciertos virus (17-21).

Los herpes virus humanos pueden participar en el desarrollo y la progresión de la enfermedad periodontal, y existen varios estudios que han investigado este fenómeno. La detección de herpes virus mediante biopsias presenta mejores resultados que la detección mediante líquido del surco por absorción de puntas de papel o muestras de placa subgingival en la bolsa periodontal (3). En este estudio se utilizaron biopsias de pacientes con periodontitis crónica, periodontits agresiva y pacientes control; sin embargo, no se encontró en ninguno de los grupos la presencia de los virus estudiados, por lo que dentro de los límites de esta investigación no se apoya una posible asociación.

La actividad de la enfermedad periodontal se estipula principalmente con parámetros clínicos como profundidad de bolsa, pérdida en los niveles de inserción, índice de placa e índice de sangrado. El sangrado al sondeo está asociado con la actividad de la enfermedad periodontal (23-25), y la ausencia de sangrado es considerada como un indicador de estabilidad periodontal (26). Ya que el estudio no detectó la presencia de ninguno de los distintos tipos de virus estudiados, se apoya una etiología principalmente bacteriana causante de los hallazgos clínicos observados. Algunas investigaciones vinculan a los herpes virus como agentes etiológicos de la enfermedad periodontal en sus formas de periodontitis marginal y periodontitis apical (27,28); en otras investigaciones se han asociado a periodontitis agresivas y a periodontitis crónica (29-33).

En esta investigación se pudieron relacionar los parámetros clínicos entre sí, obteniendo resultados estadísticamente significativos entre NI, PB, IG y IP. Los resultados obtenidos en esta investigación concuerdan con diversas investigaciones 30-33 en los que dichos parámetros presentan relación. Este dato estadístico es importante ya que la parte clínica es la que presenta mayor trascendencia a la hora del diagnóstico, pronóstico y tratamiento periodontal. Las otras ramas diagnósticas como la biología molecular son una ayuda para el clínico, sin embargo son técnicas que presentan cierto grado de complejidad y su costo es una desventaja para ser utilizado como herramienta diagnóstica de rutina; es por ello que la parte clínica es la que presenta una mayor importancia para la terapia periodontal.

En esta investigación se encontró que el grupo de pacientes sanos no presentó ninguno de los virus estudiados. Este dato coincide con previos estudios 9,30,33 en el que no se detectó la presencia de herpes virus simple tipo 1 y tipo 2, así como la ausencia de citomegalovirus. Contreras y Slots 31 no detectaron la presencia del herpes virus tipo 2 en pacientes con periodontitis, resultado que concuerda con los datos obtenidos en este estudio. La posible explicación de este fenómeno puede estar en la capacidad inmunológica de reconocimiento, ya que las moléculas virales del HSV1 y HSV 2 son similares por lo que el sistema inmune puede reconocer una molécula y desarrollar anticuerpos para el otro tipo de virus, sin embargo es una hipótesis que se encuentra en prueba.

Diversas investigaciones han detectado la presencia de los herpes virus tipo 1 y tipo 2 así como la presencia del citomegalovirus 6-10, a diferencia de nuestro estudio en el cual no se detectó ningún virus, en los distintos grupos analizados. Es importante destacar que las posibles diferencias podrían radicar en que los primeros estudios se utilizaron los oligonucleótidos diseñados por Parra y Slots en 1996. Dichos oligonucleótidos presentan características diferentes a los oligonucleótidos utilizados en este estudio. Los oligonucleótidos que se utilizaron son de 24 pares de bases para el virus herpes tipo 1, 20 pares de bases para herpes virus tipo 2 y 25 pares de bases para el citomegalovirus, mientras que los utilizados por las investigaciones previamente mencionadas son de 46 pares para HSV-1 y HSV-2 y de 48 pares para citomegalovirus. Sin embargo, se recomienda un número aproximado de 18 a 22 nucleótidos, porque es la cantidad óptima para que hibride de forma específica con el ADN del virus a buscar. Otro de los posibles factores a considerar es que las zonas a amplificar de los genes blanco son distintas en nuestro estudio comparado con los estudios mencionados anteriormente en los cuales todos utilizan los mismos oligonucleótidos.

Yapar 33 investigó la presencia del citomegalovirus en 16 pacientes con periodontitis agresiva y 17 pacientes sanos. Encontró que ninguno de los pacientes sanos presentó el virus al igual que en nuestro estudio. También observó que pacientes que fueron tratados tanto con raspado y alisado como con cirugías periodontales y terapia antibiótica, no presentaron la presencia del citomegalovirus. En este estudio a todos los pacientes se les realizó una fase higiénica completa e instrucciones de control de placa previo a la obtención de la biopsia (que se adquirió al momento de la cirugía periodontal) posible razón por la cual se obtuvieron resultados negativos tanto para el CMV como para el HSV-1 y el HSV-2. Una de las posibles explicaciones es que esta fase del tratamiento periodontal pueda alterar la composición de la flora subgingival deteniendo la correlación entre los herpes virus y bacterias.

En otros estudios 36,37 realizados donde trataron pacientes con enfermedad periodontal crónica y enfermedad periodontal agresiva en los que les realizaron raspado y alisado radicular, se encontró una disminución en las células plasmáticas, leucocitos y linfocitos, condición que disminuye la actividad de los herpes virus y citomegalovirus. Otra de las posibles razones por la cual este estudio no obtuvo resultados positivos ante los virus analizados pudo haber radicado en la edad de los pacientes ya que entre el 40% y el 70% adquieren anticuerpos contra el herpes simple desde el primer año de vida hasta la adolescencia lo que pudo haber afectado la muestra 15.

Con base en los resultados de este estudio, no fue posible comprobar la prevalencia de los virus de herpes simple tipo 1 y 2 y del citomegalovirus en pacientes diagnosticados con enfermedad periodontal crónica y enfermedad periodontal agresiva. Cabe resaltar, la enfermedad periodontal es una enfermedad inflamatoria inmunosupresora, el hecho de que no se haya encontrado virus en los pacientes con periodontitis no implica que el paciente no lo haya manifestado en algún momento, sino que el virus se encontrara en un periodo de latencia en el momento de la colecta. Por esto, se recomiendan estudios longitudinales, microbiológicos y clínicos para determinar las implicaciones patogénicas y terapéuticas de este estudio.

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