Agronomía
Costarricense 46(1): 9-24. ISSN:0377-9424 / 2022
www.mag.go.cr/rev
agr/index.html www.cia.ucr.ac.cr
CARACTERIZACIÓN
MORFOGÉNICA DE LA VAINILLA
(Vanilla planifolia ANDREWS) PARA SU PROPAGACIÓN*
Juan
Villegas-Ramírez1/**, Tomás Palma-Zúñiga2
Palabras
clave: Vanilla planifolia; Biorreactores de
Inmersión Temporal; multiplicación, organogénesis.
Keywords: Vanilla planifolia;
Temporary Immersion Bioreactors; multiplication; organogenesis.
Recibido: 16/02/2021 Aceptado: 08/09/2021
RESUMEN
Introducción. La vainilla (Vanilla
planifolia Andrews) es una orquídea que se cultiva comercialmente para la
producción de vainillina, una sustancia saborizante que se emplea
principalmente en la industria alimenticia y como cosmético. Aunque la demanda
ha motivado su cultivo, hay poca disponibilidad de semilla vigorosa y libre de
enfermedades lo cual ha sido una limitante. Se ha demostrado que los sistemas
de inmersión temporal son eficientes. Para la micropropagación masiva de la
vainilla, aún no se han establecido estudios de tiempo, frecuencia de inmersión
y volumen óptimo en la proliferación de brotes en Biorreactores de Inmersión
Temporal (BIT) y además se desconoce una ruta morfogénica que garantice la
estabilidad genética y la optimización durante el proceso de micropropagación. Objetivo.
Caracterización morfogénica de la vainilla (Vanilla
planifolia Andrews) en un BIT. Materiales y métodos. Se realizaron 3
experimentos, cada uno con 3 tratamientos. Para el primer experimento, se
consideraron tiempos de 5, 10 y 15 min para los tratamientos, en el segundo se
evaluaron 3 frecuencias en tiempos de 6, 12 y 18 horas y en el tercero se
consideraron 20, 30 y 40 ml/explante como volumen de
medio de cultivo. Para los diferentes tratamientos se utilizaron 5
repeticiones, con una unidad experimental de 10 explantes
y segmentos de tallo con 3 yemas axilares. El medio de cultivo consistió en las
sales de Murashige Skoog (MS) suplementado con 1 mg.L-1 de BA y 1 g.L-1 de caseína. El
fotoperiodo se ajustó a 16 horas luz, con una temperatura de 27°C±3 y una
humedad relativa de 80% Resultados. Se obtuvieron diferencias
estadísticas (p<0,05) respecto a los tiempos evaluados, frecuencia de
inmersión y el volumen por explante. Se determinó
como mejor tiempo de inmersión un periodo de 15 minutos, 6 horas como
frecuencia de inmersión y 40 ml como volumen de medio por explante.
Al comparar la respuesta de desarrollo, el sistema BIT superó al medio
semisólido 1,8 veces en el número de brotes y 4 veces en el incremento de peso
fresco. También con BIT se obtuvieron 36 brotes por explante
mientras que en el sistema de cultivo en medio
semisólido, se obtuvieron 20 brotes por explante. Conclusiones.
Mediante el empleo del sistema BIT, se optimizó el mecanismo de
micropropagación de V. planifolia comparado con el medio de cultivo
semisólido en la ruta organogénica directa, lo cual fue demostrado con la
formación de brotes preformados y brotes adventicios.
ABSTRACT
Morphogenic
characterization of vanilla (Vanilla planifolia
Andrews) for propagation. Introduction. Vanilla (Vanilla planifolia
Andrews) is an orchid that is commercially grown for the production van, a
flavoring substance that is used mainly in the food industry and as a cosmetic.
Although the demand has motivated its cultivation, there is little availability
of vigorous seed and free which has been a limited. Temporary immersion systems
have been shown to be efficient. For their massive micropropagation but studies
of time, immersion, frequency and optimal volume have not yet been established
in the proliferation of shoots in Temporary Immersion Bioreactors (BIT),
furthermore, a morphogenic pathway that guarantees genetic stability and
optimization during the micropropagation process is unknown. Objective.
Morphogenic characterization of vanilla (Vanilla planifolia
Andrews) in a BIT. Materials and methods. Three experiments were carried
out, each with 3 treatments. For the first experiment, the immersion time
considered the treatments of 5, 10 and 15 min, in the second experiment 3
frequencies were evaluated at times of 6, 12 and 18 hours and in the third
experiment were considered 20, 30 and 40 ml/explant as volume of culture
medium. For the differents treatments used 5
repetitions, with an experimental unit of 10 explants and stem segments with 3
axillary buds. The culture medium consisted of Murashige
Skoog (MS) salts supplemented with 1 mg.L-1
of BA and 1 g.L-1 of casein. The photoperiod was adjusted to 16
light hours, with a temperature of 27°C±3 and a relative humidity of 80%. Results.
Statistical differences (p<0,05) were obtained with respect to the evaluated
times, frequency of immersion and the volume per explant. A period of 15
minutes it was determined as the best immersion time, 6 hours as the immersion
frequency and 40 ml as the volume of medium per explant. When comparing the
development response, the BIT system exceeded the semisolid medium 1.8 times in
the number of shoots and 4 times in the increase in fresh weight. In addition,
36 shoots were obtained per explant in BIT, while in the culture system in
semi-solid medium, a multiplication rate of 20 shoots per explant. Conclusions.
By using the BIT system, the micropropagation mechanism of V. planifolia was optimized compared to the semi-solid
culture medium in the direct organogenic route, which
was proved with the formation of preformed shoots and adventitious shoots.
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* Investigación producto de la Maestría en
Ciencia y Tecnología para la Sostenibilidad, del programa de posgrado del
Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo (DOCINADE).
** Autor para correspondencia. Correo
electrónico: juan7villegas@estudiantec.cr
1 Instituto
Tecnológico de Costa Rica (ITCR), Escuela Técnica Agrícola e Industrial (ETAI),
Santa Clara, San Carlos, Costa Rica.
0000-0001-9490-3507.
2 Escuela Técnica
Agrícola e Industrial (ETAI), Centro de Investigación en Agroindustria,
Biotecnología y Veterinaria (CIABIV), Santa Clara, San Carlos, Costa Rica.
0000-0002-2862-7003.
INTRODUCCIÓN
El género Vanilla está representado por un grupo de
lianas que comprende 126 especies pertenecientes a la familia Orchidacea (Damian y Mitidieri 2020, Azofeifa-Bolaños et al. 2019, Soto y
Dressler 2010, Bory et al. 2008). Según Gelski (2019). En los últimos años se incrementó la demanda
de la vainilla a nivel mundial, sin embargo, la oferta del cultivo ha sido
escasa y como consecuencia ha generado precios hasta de 600 dólares por kg,
aspecto de interés para productores. Granados (2018) señaló que la oferta de
vainilla de Madagascar, principal país productor del cultivo en el mundo,
disminuyó en un 38% desde el 2017, debido a la afectación sufrida por el
huracán Henawo.
Sin
embargo, también se deben atender otros aspectos como su propagación, la cual
se puede realizar tanto por el método sexual como asexual, aunque el primero es
menos eficiente, debido a que es común que las semillas presenten un bajo
porcentaje de germinación (Yeh et al. 2021).
El método asexual o por esquejes de tallos requiere alta mano de obra y
disponibilidad de más tiempo, lo cual incrementa costos y reduce la viabilidad
de este tipo de proyecto (Azofeifa 2014). Por lo general las plantaciones
establecidas por esquejes se ven afectadas por diversas enfermedades
principalmente por la marchitez provocada por Fusarium oxysporum
f. sp. vanillae,
que ocasiona necrosis de raíces y tallos (Adame et al. 2015).
Con el
interés de abastecer la demanda del cultivo, a partir del uso de genotipos de
vainilla de alto rendimiento, resistentes a Fusarium oxisporium
f.sp vanillae (Iglesias-Andreu 2018), se ha trabajado con
técnicas de micropropagación in vitro o propagación clonal bajo condiciones
controladas de laboratorio.
Se han
publicado protocolos de micropropagación para producir masivamente plantas de
vainilla libres de plagas y enfermedades mediante organogénesis procedentes de
yemas axilares (George y Ravishankar 1997), asimismo
por embriogénesis somática y organogénesis mediante la inducción del callo (Janarthanam y Sheshadri 2008).
Otras investigaciones con técnicas de micropropagación en el cultivo in vitro
en vainilla, citan el trabajo de Philip y Nainar
(1986) en el desarrollo de terminales de raíz a meristemos vegetativos,
posteriormente, mediante los estudios se ha identificado que el estímulo
directo de reguladores de crecimiento como la benziladenina
se han utilizado para explantes de ápices del tallo (Abebe et al. 2009, Gantait
et al. 2009, Tan et al. 2013). También la adición de reguladores
del crecimiento como el ácido naftalenacético (NAA) y
la 6-bencilaminopurina (BAP) en el medio de cultivo MS es frecuente en la
micropropagación de la vainilla (Murashige y Skoog
1962). También se conoce que la utilización de aditivos como lo es
lignosulfonato de calcio (Ca-LIGN) y el lignosulfonato de sodio (Na-LIGN) sobre la multiplicación y regeneración del cultivo
a partir de brotes de V. planifolia (Abdullah et al.
2020).
A pesar de
los beneficios de la micropropagación en medios semisólidos para la obtención
de plantas libres de enfermedades, han surgido limitaciones debido a la
necesidad de realizar subcultivos frecuentes cuando el medio de cultivo se
agota. Además, los volúmenes de medio de cultivo en medios semisólidos son
relativamente pequeños pues han presentado rangos entre 10 a 30 ml/explante según el frasco de cultivo, y más requerimiento de
mano de obra, que a su vez genera problemas de contaminación por manipulación,
en conjunto aspectos por los cuales se consideró como alternativa, el uso de
Sistemas de Inmersión Temporal (SIT). Estos son sistemas automatizados en medio
líquido que garantizan la oxigenación, permiten minimizar los costos de
producción y la contaminación por manipulación; además proporcionan contacto
uniforme en todo el explante, aspecto que favorece la
sustitución del medio de cultivo líquido sin remplazar el frasco (Watt 2012).
Sin embargo, investigaciones realizadas con el SIT en vainilla, no reportan
respuestas morfogénicas durante la micropropagación y requieren ser
identificadas con el fin de optimizar los factores químicos y físicos que las
controlan. Y asimismo, garantizar la estabilidad
genética de las plantas obtenidas in vitro (Alatorre 2002, Palama et al.
2010).
El SIT se
ha diseñado y modificado con la utilización de diferentes tipos de frascos y
diferentes mecanismos que impulsan el medio de cultivo mediante agitación
mecánica o neumática. Los diseños de SIT fueron expuestos y descritos en
detalle por Etienne y Berthouly
(2002) y Paek et al. (2001), Paek et al. (2005).
También la
eficiencia de los Sistemas de Inmersión Temporal ha sido motivo de una revisión
de literatura por parte de Georviev et al.
(2014) quien se refirió al funcionamiento de esos sistemas, y su diseño tecnológico,
mediante ejemplos de la aplicación de estos sistemas en micropropagación de
plantas tanto a nivel de laboratorio como en terrenos para su producción.
Ramírez-Mosqueda
e Iglesias-Andreu (2016) evaluaron 3 diferentes sistemas de inmersión temporal
para micropropagar la vainilla: Biorreactores de inmersión temporal (BIT®),
Biorreactores de inmersión por gravedad (BIG) y receptor para inmersión
temporal automatizada (RITA®). Los resultados obtenidos reportaron mayor número
de brotes/explantes (18,06) obtenidos en BIT®,
seguido de RITA® (12,77) y BIG (7,83), sin embargo, esta investigación no
indicó el tiempo, la frecuencia y tampoco el volumen de medio/explantes específicos para los BIT. Tanto la frecuencia
como el volumen de medios usados en BIT han sido los recomendados para su
análisis por Ramos-Castellá et al. (2014) para el sistema RITA®.
Para el
presente estudio en particular, se utilizó el Biorreactor de Inmersión Temporal
(BIT), propuesto por Escalona et al. (1999).
El objetivo
fue investigar caracterización morfogénica de la Vainilla (Vanilla
planifolia Andrews) mediante un biorreactor de inmersión temporal.
MATERIALES Y
MÉTODOS
Material
experimental. Se
utilizaron plántulas in vitro de Vanilla
planifolia, procedentes del laboratorio de Biotecnología del Instituto
Tecnológico de Costa Rica, Sede Regional de Santa Clara, San Carlos. Las yemas
axilares provenían de las plántulas in vitro que fueron subcultivadas
3 veces con 30 días de intervalo para obtener plántulas de aproximadamente 10
cm de longitud; luego se seleccionaron como explante
los segmentos de tallo de las plántulas in vitro conteniendo 3 yemas axilares
de 5 cm de longitud.
Medio de
cultivo. Se utilizaron 2
medios de cultivo, el primero con las sales Murashige
y Skoog 1962 (MS) solidificado con Agar (4,4 g.L-1) y el segundo
medio preparado para el BIT con las sales MS carente de agar. Ambos tipos de
medio de cultivo contenían las sales y vitaminas MS y fueron enriquecidos con
30 g.L-1 de sacarosa y suplementado con 1 mg.L-1
de bencil adenina (BA), 1 mg.L-1 caseína y
1 ml.L-1 de Plant Preservative Mixture™
(PPM) como prevención al ataque de bacterias y hongos. El pH se ajustó a 5,7 y
posteriormente se esterilizó en autoclave durante 29 minutos por litro de medio
de cultivo, a una temperatura de 121°C y una presión de 15 psi (Palma 2013).
Tratamientos
para evaluar la respuesta de vainilla en un Biorreactor de Inmersión Temporal
(BIT). Para determinar
las respuestas de la vainilla en BIT®, se realizaron 4 experimentos y se
seleccionó el que presentó el mayor número de brotes durante su multiplicación
según el tiempo y frecuencia de inmersión así como el
volumen de medio. Posteriormente se evaluó la respuesta de los explantes de vainilla mediante comparación del sistema BIT®
con el método convencional en medio semisólido. En cada uno de los primeros 3
experimentos se evaluaron 3 tratamientos con 5 repeticiones semanalmente
durante 6 semanas. Los mismos se describen a continuación.
Experimento
1. Tiempo de inmersión. Los
tratamientos evaluados fueron: 5, 10 y 15 minutos. En esta etapa de
multiplicación, el volumen fue de 300 ml por unidad BIT® (30 ml por explante) como constante. La frecuencia de inmersión
utilizada como constante fue de 12 horas. Se utilizaron 10 explantes
por recipiente de cultivo, con 5 repeticiones y se evaluaron semanalmente
durante 6 semanas.
Experimento
2. Frecuencia de inmersión. Se evaluaron 3 frecuencias de inmersión para los siguientes tratamientos:
cada 6, 12 y 18 horas. Se utilizaron 10 minutos como mejor tiempo de inmersión
según los resultados obtenidos en el experimento 1 y se estableció como
constante el volumen de 30 ml/explante, 10 explantes formaron la unidad experimental y cada
tratamiento fue replicado 5 veces. Las evaluaciones se realizaron semanalmente
durante 6 semanas.
Experimento
3. Volumen del medio de cultivo. En esta etapa se evaluaron 3 volúmenes de medio: 20, 30 y 40 ml por explante. El tiempo y la frecuencia de inmersión se
seleccionaron de los experimentos 1 y 2, donde se cuantificaron los mejores
resultados en las variables evaluadas. Para cada tratamiento se utilizaron 5
repeticiones. La unidad experimental se conformó con 10 explantes.
Las variables se evaluaron semanalmente durante 6 semanas.
Experimento
4. Evaluación de medios de cultivo en BIT vs medios solidificados. Una vez culminados los 3 experimentos, con
tiempo de inmersión, frecuencia de inmersión y volumen de medio, se procedió a
realizar la comparación de resultados obtenidos en el sustrato semisólido y el
medio líquido en BIT, según las mejores respuestas de tiempo y
frecuencia de inmersión y el volumen de medio. Las variables también se
evaluaron semanalmente durante 6 semanas.
Condiciones
físicas del cuarto de crecimiento. En los 4 experimentos la temperatura del cuarto de crecimiento se reguló
mediante aire acondicionado a 27±3C°; la intensidad lumínica fue de 3000 lux,
el fotoperiodo fue de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad; la humedad relativa
presentó un valor de 80% en promedio.
Análisis
diseño experimental. Para
los 3 primeros experimentos se utilizó un diseño completamente al azar con 4
repeticiones y los datos se procesaron estadísticamente con el sistema de
análisis estadístico SAS. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y los
resultados se ajustaron a una ecuación de regresión. El cuarto experimento se
analizó mediante la prueba de t student para
determinar la respuesta de los explantes de vainilla
en medio semisólido de cultivo en BIT®.
Variables
evaluadas. Las variables
evaluadas cada semana y durante 6 semanas, fueron el número de brotes, longitud
de brote (cm), número de hojas del brote, longitud de la lámina foliar del
brote (cm), número de raíces, longitud de raíces (cm) e incremento de peso (g).
Histología.
Los brotes de V.
planifolia se fijaron en formaldehído: ácido acético, alcohol, ácido
acético (FAA) (1:1:8 v/v), durante 4 días, se deshidrataron en una serie
ascendente de alcoholes hasta llegar a xileno y luego la infiltración en paraplast de FisherbrandtTM.
Se cortaron secciones delgadas de 10 µm mediante un micrótomo rotatorio (Leica
RM2125 RTS). La tinción se hizo con verde CFC y safranina para observarlos al
microscopio compuesto (Optima G302).
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Efecto
del tiempo de inmersión temporal de los BIT en explantes
de Vanilla planifolia. El análisis de varianza mostró diferencias
significativas y altamente significativas para las variables número de brotes y
longitud de raíces respectivamente, evaluadas 6 semanas después de la siembra
como respuesta al tiempo de inmersión. La mayor respuesta en el número de
brotes se evidenció en el tratamiento de 15 min de inmersión con 29,14 brotes y
la mayor longitud de raíces (20 mm) se obtuvo con este mismo tratamiento (Tabla
1).
Tabla 1. Multiplicación de Vanilla
planifolia en BIT con 3 tiempos de inmersión, semana 6 después de la
siembra.
* diferencia significativa para p<0,05. n=10.
** diferencias altamente significativas
para p<0,001. n=10.
Para
definir el mejor tiempo de inmersión se consideraron las variables con
diferencias significativas (p<0,05) y altamente significativas (p<0,01) y
se ajustaron a un modelo de regresión lineal, lo que confirmó que el tiempo de
inmersión influye en el número de brotes y la longitud de raíces de vainilla en
BIT®.
Adicionalmente,
los frascos gemelos (BIT®) que fueron propuestos por Escalona et al.
(1999), (Watt 2012) esclarecieron que la duración y frecuencia de inmersión
constituyen los factores más importantes para una micropropagación exitosa, ya
que influyen en la absorción de nutrientes y agua aspecto que también se asocia
a la hiperhidricidad de los tejidos cultivados
(Escalona et al. 2006).
También los
trabajos de micropropagación en sistemas de inmersión temporal en vainilla han
sido realizados en recipientes conocidos como RITA® con la
aplicación de 2 minutos de inmersión y con diferentes tipos explantes
tal y como lo indican las publicaciones, González (2003) mencionó que el uso de
yemas axilares y yemas terminales vainilla; Ramos-Castellá et al. (2014)
quienes utilizaron segmentos nodales de vainilla; Ramírez-Mosqueda et al.
(2016) utilizaron “cluster” provenientes de yemas
axilares y Spinoso-Castillo (2017) iniciaron la
micropropagación en sistemas de inmersión por medio de segmentos nodales
provenientes de yemas axilares. Un trabajo de micropropagación en vainilla
similar a los biorreactores lo realizaron Sreedhar et
al. (2009) con “cluster” de explantes
en medios líquidos en agitación. Se identificó que el tiempo de inmersión
utilizado en sistemas de inmersión temporal varía de manera importante según la
especie y del tipo de sistema de inmersión temporal que se seleccionara para la
micropropagación de plantas (Georgiev et al. 2014).
Para la
micropropagación de vainilla se utilizaron 3 tipos de sistemas de inmersión
temporal a saber: Biorreactores de inmersión temporal (BIT®), biorreactores de
inmersión por gravedad (BIG) y receptor para inmersión temporal automatizada
(RITA®) con un protocolo propuesto por Ramos-Castellá et al. (2014), la
mayor de brotes por explante los obtuvo en el medio
de cultivo de BIT® con 18,6 brotes, seguido de RITA® con 12,77 brotes y por
último el BIG con 7,83 brotes (Ramírez Mosqueda et al. 2016). La máxima
cantidad de brotes de vainilla obtenidos en este estudio fue de 29,14 brotes
(Tabla 1) cuando los explantes fueron sometidos al
tratamiento de 15 minutos de inmersión, valor superior al número de brotes /explante de vainilla obtenidos por Ramos Castellá et al.
(2014) (18,6 brotes/explante) con el BIT® como
sistema de inmersión temporal.
Efecto
de la frecuencia de inmersión de los BIT en explantes
de V. planifolia. En el estudio de la frecuencia de inmersión el análisis de varianza mostró
diferencias altamente significativas para las variables número de brotes y
número de hojas evaluados 6 semanas después de la siembra. El mayor número de
brotes y hojas, 33,7 y 34,73 respectivamente se obtuvo con una frecuencia de
inmersión de cada 6 horas y decreció conforme disminuía el contacto con el
medio de cultivo (Tabla 2).
Tabla 2. Multiplicación de Vanilla
planifolia en BIT con 3 frecuencias de inmersión en la semana 6 después de
la siembra.
* diferencia significativa para p<0,05. n=10.
** diferencias altamente significativas
para p<0,001. n=10.
Las
variables longitud de brotes, longitud de lámina foliar número de raíces y
longitud de raíces e incremento de peso fresco, no mostraron diferencias
estadísticas a las 6 semanas de evaluadas después de la siembra.
Resultados
similares encontraron Basail et al. (2012) al evaluar el tiempo y
frecuencia de inmersión en la micropropagación de plátano, ya que ambas
variables, influyeron en la absorción de nutrientes y agua con afectación del
coeficiente de multiplicación y la calidad de las plantas micropropagadas. La
frecuencia de inmersión varió según la especie estudiada, el sistema de
inmersión temporal empleado y la ruta de morfogénesis tal y como lo demuestra
la revisión de Watt (2012), quien estableció las frecuencias de inmersión entre
30 segundos cada 10 minutos en (Eucalyptus grandis) y en sistemas RITA® (McAlister et al. 2005) y hasta 30 minutos cada 4
horas en el cultivo de Lessertia frutescens en un biorreactor de inmersión temporal
mediante burbujeo, B.I.B®, (Shaik et al. 2010). En las investigaciones
realizadas por Ramos et al. (2014), Ramírez et al. (2014), Spinoso-Castillo et al. (2017), González (2003) en
sistemas de inmersión tipo RITA® en Vainilla planifolia se
determinó una frecuencia de inmersión de 4 horas.
Efecto
del volumen de medio de los BIT en explantes de Vanilla planifolia. Una vez determinado el tiempo y frecuencia de
inmersión se evaluó el volumen de medio por explante,
el cual mostró diferencias altamente significativas en las variables número de
brotes, longitud de brotes, número de hojas e incremento de peso fresco,
evaluadas 6 semanas después de la siembra (Tabla 3). Las variables longitud de
lámina foliar, número y longitud de raíces no presentaron diferencias
estadísticas durante ese tiempo de evaluación.
Tabla 3.
Multiplicación de Vanilla planifolia
en BIT® con 3 volúmenes de medio por explante, semana
6 después de la siembra.
*diferencia
significativa para p<0,05. n=10.
**diferencias
altamente significativas para p<0,001. n=10.
Se ha
evidenciado que el volumen del frasco y el medio de cultivo líquido están
relacionados con el número de los explantes como
factores determinantes en la micropropagación en biorreactores de inmersión
temporal (Watt 2012). Con los tratamientos evaluados se determinó que a mayor
volumen por explante mayor es la respuesta en el
número de brotes durante la micropropagación de Vanilla
planifolia. Los resultados obtenidos se ajustaron a una ecuación de
regresión que establece que por cada 10 ml de medio de cultivo que se aumente
en el BIT® se incrementa un promedio de 5,3 brotes, 3,8 hojas y 5,21 gramos de
peso fresco con un R2 de 0,75 – 0,076 – 0,65 respectivamente. La
longitud del brote disminuyó en 0,16 cm con un R2 de 0,65 según el
análisis de regresión realizado.
Estudio
de comparación de la micropropagación de Vanilla
planifolia en un sistema de inmersión temporal y un medio semisólido. El estudio de respuesta de explantes en la micropropagación de V. planifolia
por medio de la prueba de contrastes de medias (t de student),
mostró diferencias altamente significativas para las variables número de
brotes, número de hojas e incremento de peso fresco al comparar el sistema de
inmersión líquido (BIT) con el de medio semisólido durante 6 semanas. De esta
manera se comprobó que el sistema de inmersión temporal influyó
significativamente en la formación de brotes y superó en 16 el número de brotes
al sistema de cultivo en medio semisólido. Resultados similares obtuvieron
Bello-Bello et al. (2014) y Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu (2016) al
evidenciar que el cultivo de vainilla en Biorreactores resultó ser más
eficiente, ya que generó 12 brotes por explante en
promedio, mientras que la vainilla micropropagada en el cultivo en medio
semisólido solo produjo una tasa de multiplicación de 7 brotes por explante.
Los brotes
formados en un sistema de inmersión temporal, tuvieron mayor superficie de
contacto con el medio de cultivo líquido este sistema de cultivo permitió
combinar la aeración con el burbujeo de la inmersión, ya que tomó del medio de
cultivo los nutrientes y reguladores de crecimiento de forma más eficiente
(Ramos-Castellá et al. 2014).
El número
de hojas fue superior en BIT® con un promedio de 26 hojas mientras que en el
sistema de cultivo semisólido se determinaron 15 hojas. Además, se comprobó la
influencia del sistema líquido para la variable incremento de peso fresco, ya
que con un valor de 26 g incrementó en peso fresco obtenido con el BIT® y
superó los 6 g que se obtuvieron en el sistema semisólido (Figura 1 B). Se ha
demostrado que especies micropropagadas en el sistema BIT® producen mayor
cantidad de brotes/explante cuando se comparan con el
número de brotes/explante obtenidos en medios de
cultivos semisólidos (Escalona et al. 2006). En el caso del cultivo de
la vainilla, se obtuvo mayor cantidad de brotes en sistemas de inmersión
temporal tipo RITA® al compararlo con los brotes/explante
obtenidos en medios semisólidos (Bello-Bello et al. 2014).
Figura 1. Efecto comparativo de los sistemas BIT y el
medio semisólido. (a) número de hojas (b) incremento en peso fresco (c) número
de brotes en V. planifolia, 6 semanas después de iniciada la siembra.
Respuestas
morfogénicas de Vanilla planifolia y
observaciones histológicas obtenidas en los BIT. Las respuestas morfogénicas observadas en este
estudio incluyeron el estímulo de brotes preformados, el estímulo de brotes
adventicios con la formación de “cluster” y la
transformación del meristemo radical en meristemos vegetativos (Figura 2).
Figura 2. Morfología de estructuras regeneradas a partir
de explantes de V. planifolia en BIT con
tiempo de inmersión de 15 min, frecuencia de inmersión de 6 horas y volumen de
medio de 40 ml/explante. (a) Estímulo del brote apical
señalado con las flechas. (b) Estímulo de brotes axilares y formación de las
raíces antes de su transformación en meristemos del brote. (c) Transformación
de meristemos de raíz en meristemos vegetativos a partir de una masa de tejido
meristemático (d) Estímulo de brotes adventicios que inician la formación de “cluster” y se demuestra la cantidad de brotes y biomasa
alcanzada.
En los
brotes de vainilla que produjeron raíces se evidenció la transformación del
meristemo radical a meristemos vegetativos a través de la ruta organogénica
directa detectada mediante la histología. En esta investigación, no se
observaron estructuras que mostraran una ruta bipolar.
El sistema
BIT® favoreció la formación de estructuras denominadas “cluster”
cuyo análisis histológico mostró una ruta organogénica (Figura 3) u
organogénesis de novo según Sugiyama
(1999), en un proceso de desdiferenciación de células y su reorganización en la
división celular, con la formación de primordios y meristemos de órganos
específicos. Los brotes y raíces de las plantas conservaron las funciones
meristemáticas, aun si se eliminara parte o todos sus meristemos de la raíz o
del tallo; además, las células vegetales de tejidos u órganos diferenciados
tienen la capacidad de producir nuevos brotes y raíces laterales a través de la
organogénesis (Zhang et al. 2018, Ikeuchi et
al. 2016).
Figura 3. Análisis histológico de rutas morfogénicas en V.
planifolia como respuesta a sistemas de cultivo BIT con tiempo de inmersión
de 15 min, frecuencia de inmersión de 6 horas y volumen de medio de 40 ml/explante. (a) Formación de estructuras organogénsis
que conducen a la formación de “un cluster”, (b)
Grupo de células meristemáticas organizadas y diferenciación de múltiples
estructuras a partir de meristemoides localizado en
la parte distal de la raíz 6 semanas después de la siembra en un BIT®.
Las rutas
morfogénicas de V. planifolia observadas en los BIT®, se desarrollaron
en medio de cultivo que se suplementó con BA como citocinina
en una concentración de 1mg.L-1 y la biomasa cuantificada como
incremento en peso fresco y formación de brotes en presencia de BA en el medio
de cultivo que presume ser uno de los factores determinantes en la formación de
brotes preformados, y en el estímulo de brotes adventicios en V. planifolia.
El estudio de Alatorre (2002) evidenció que la presencia de BA en el
medio de cultivo, interviene en la organogénesis in vitro de Vainilla tanto en
brotes axilares como en terminales de raíz.
Respecto a
la morfología de estructuras regeneradas a partir de explantes
de V. planifolia en BIT® como respuesta al tiempo de inmersión,
frecuencia de inmersión y volumen de medio de cultivo se evidenció que se
siguieron la ruta de organogénesis directa, que estimuló la formación de brotes
preformados y de brotes adventicios tanto a partir de yemas axilares como de
las terminales de raíz. Por su parte, la ruta organogénica en los explantes sembrados, inició con el desarrollo del brote
apical y posteriormente con el de los brotes axilares. Las raíces formadas
presentaron engrosamientos en el meristemo a través de una transformación de
los meristemos radicales en meristemos vegetativos visibles una semana después
de la siembra. Otra respuesta organogénica observada en los explantes
de vainilla fue la formación de brotes adventicios organizados que se
conformaron en “cluster” (Figura 2).
El análisis
histológico de las estructuras obtenidas, evidenciaron a través del vínculo de
bandas procambiales, a la ruta organógenica
como la respuesta de los explantes de V.
planifolia en los BIT empleado para su micropropagación (Figura 3).
En la misma
figura se observa el corte longitudinal de la terminal de la raíz engrosada
presentó diferenciación de múltiples brotes a partir de meristemoides
formados en la parte distal del extremo de la raíz presente. Estos resultados
coinciden con el estudio realizado por Philip y Nainar
(1988) en medios semisólidos, quienes señalaron que las respuestas de
transformación de meristemos radicales a meristemos vegetativos en V.
planifolia, solo se manifiesta en raíces nuevas en interacción del corte
realizado y la interacción con auxinas endógenas, al centro de quiescencia a la
formación de brotes y raíces en estas terminales de raíces.
Asimismo se
constató que la ruta morfogénica directa obtenida, garantiza la estabilidad
genética esperable del material micropropagado, ya que reportó altos niveles de
variación somaclonal durante la regeneración de
callos en V. planifolia (Divakaran et al.
2015, Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu 2016), que es útil cuando se requiera
promover la diversidad genética en V. planifoliam,
sin embargo, no es recomendable cuando se necesite material genético con
motivos comerciales. Otro aspecto es que los subcultivos analizados en
laboratorio mostraron afectación en su estabilidad genética, pues se evidenció
que los 6 a 10 subcultivos de vainilla in vitro con un medio suplementado con
8,86 μM BAP, mostraron variación genética (Pastelín Solano et al. 2019).
Por medio
de la investigación se observó que la trasformación de los meristemos de raíz
en meristemos vegetativos; ocurrió en presencia de benciladenina
y caseína hidrolizada en un medio de inmersión temporal muy similar a lo
descrito por Philip y Nainar (1988). Además, el uso
de benciladenina en el medio de cultivo para la
transformación del meristemo radical en vegetativo coincidió con los resultados
obtenidos por Alatorre (2002), quién señaló efectos de la benciladenina
sobre la velocidad de desintegración de la caliptra y formación de estructuras
vegetativas en las terminales de raíz.
Se
evidenció la eficiencia de los BIT® en la micropropagación de V. planifolia
y se estableció la ruta organogénica directa con la formación de brotes
preformados y brotes adventicios, lo cual lo que garantiza su estabilidad
genética (Divakaran et al. 2015, Ramírez y
Iglesias 2015), además la eficiencia mostrada con los BIT comparado con el
medio de cultivo en medio semisólido ofrece una nueva opción para la
micropropagación de esta orquídea a gran escala.
Finalmente
se reporta que esta investigación, es el primer informe de organogénesis de Vanilla planifolia evidenciado mediante
histología y obtenida en este estudio de BIT® con un tiempo de inmersión de 15
min, frecuencia de inmersión de 6 horas y volumen de medio de 40 ml/explante, que ha presentado diferencias significativas en
número de brotes, número de hojas e incremento de peso fresco en comparación
con el medio semisólido.
AGRADECIMIENTO
A la
Escuela Técnica Agrícola e Industrial (ETAI), al Instituto Tecnológico de Costa
Rica (ITCR) y a todas las personas que de forma directa o indirecta apoyaron
este estudio.
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