6.Solano-Ident Meloidogyne

Agron. Mesoam. 26(2):247-256. 2015

ISSN 2215-3608 DOI: http://dx.doi.org/10.15517/am.v26i2.19280

IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE Meloidogyne ASOCIADAS A PLANTAS ORNAMENTALES DE ALTURA EN COSTA RICA1

Stefany Solano-González2, Alejandro Esquivel-Hernández2, Ramón Molina-Bravo3, Bernal Morera-Brenes3

RESUMEN

Identificación de especies de Meloidogyne asociadas a plantas ornamentales de altura en Costa Rica. El objetivo del presente trabajo fue identificar especies de nematodos del género Meloidogyne asociadas a plantas ornamentales de altura. El estudio se realizó en el cantón de San Isidro de Heredia, Costa Rica, en un vivero comercial durante el periodo 2011-2012, en diez especies de plantas. Para la identificación se utilizaron mediciones morfométricas de la longitud del estilete, tamaño de cola y región hialina de los juveniles en segundo estado de desarrollo (J2); también se obtuvieron diseños perineales de hembras ovígeras. Se extrajo ADN genómico de un solo individuo J2 y se realizaron análisis mediante la amplificación del espacio intergénico entre la subunidad II del citocromo oxidasa (COII) y la subunidad larga del gen ARN ribosomal mediante la técnica PCR-RFLP. La integración de estos métodos permitió identificar cinco especies de nematodos del género Meloidogyne (M. arenaria, M. hapla, M. hispanica, M. incognita, M. javanica), y se reportaron nuevos patrones de restricción con la enzima AluI para M. hapla y M. javanica. Además se obtuvo el reporte preliminar de M. hispanica, descrito mediante la secuenciación de las regiones del 18S y 28S.

Palabras clave: PCR-RFLP, Meloidogyne hispanica, nematodos fitoparásitos.

ABSTRACT

Identification of Meloidogyne species associated with upland ornamentals plants in Costa Rica. The objective of this study was to identify nematodes species of the genus Meloidogyne associated with upland ornamental plants. We sampled ten ornamental species in a commercial nursery in San Isidro, Heredia, Costa Rica between 2011-2012. Morphometric measurements of the stylet length, the tail length, and the hyaline region of J2s, as well as perineal patterns of egg-carrying females were used for identification, Genomic DNA was extracted from single J2s and molecular analyses were performed by amplifying the intergenic region between cytochrome oxidase subunit II of the COII and the long subunit of the ARN ribosomal genes by PCR-RFLP. Combining these methods allowed identification of five species of nematodes of the genus Meloidogyne (M. arenaria, M. hapla, M. hispanica, M. incognita and M. javanica), and new restriction enzyme patterns were reported for M. hapla and M. javanica using AluI. Additionally, a preliminary report of M. hispanica was described by sequencing the 28S and 18S regions.

Keywords: PCR-RFLP, Meloidogyne hispanica, phytoparasitic nematodes.

1 Recibido: 21 de octubre, 2014. Aceptado: 8 de febrero, 2015. Esta investigación forma parte del proyecto “Diagnóstico y caracterización bioquímica y molecular de nematodos noduladores (Meloidogyne spp.) en cultivos tropicales y hortícolas de Costa Rica” financiado por la Fundación RUSA-CSIC y corresponde a los resultados parciales de la tesis de Licenciatura en Manejo de Recursos Naturales de la primera autora.

2 Universidad Nacional, Escuela de Ciencias Agrarias, Laboratorio de Nematología. 86-3000. Heredia, Costa Rica. stefany.solano.gonzalez@una.cr, alejandro.esquivel.hernandez@una.cr

3 Universidad Nacional, Escuela de Ciencias Agrarias, Programa de Biotecnología Vegetal y Recursos Genéticos para el Mejoramiento. 86-3000. Heredia, Costa Rica. ramon.molina.bravo@una.cr, bernal.morera.brenes@una.cr

INTRODUCCIÓN

Los nematodos fitoparásitos provocan, a nivel mundial, cuantiosas pérdidas económicas en la producción agrícola (Neher, 2001; Chávez-Velazco et al., 2009; Castro et al., 2011). Un grupo de gran importancia en sistemas agrícolas tropicales y subtropicales es el nematodo formador de nódulos del género Meloidogyne Goeldi, 1892 (Olsen, 2000; Sidiqqi, 2000; Salazar-Antón y Guzmán-Hernández, 2013a), debido a su amplia distribución geográfica, ámbito de hospederos e importancia económica como agente patógeno (Orui, 1999). El género incluye más de ochenta especies con más de 5000 plantas hospederas (Powers y Harris, 1993; Sidiqqi, 2000; Brito et al., 2004; Subbotin y Moens, 2006).

En Costa Rica, la importación y exportación de plantas ornamentales tuvo una evolución significativa en los últimos años, donde se generaron divisas de hasta 83,2 millones de dólares (Arce et al., 2009; Acuña y Barrientos, 2010; Barahona et al., 2011; SEPSA, 2011). Por lo tanto, es importante conocer las especies de nematodos asociadas a estos cultivos. Los nematodos formadores de nódulos en cultivos ornamentales, no solamente los afecta en forma directa, sino que también predisponen a la planta al ataque de otros patógenos del suelo (Richardson y Grewal, 1993); cuyo efecto en la planta hospedera se manifiesta en forma de poco crecimiento, clorosis, marchitamiento, baja productividad y en casos severos muerte de la planta. Según Ortuño y Oros (2002), pueden existir pérdidas de hasta un 100% causadas por la pobre calidad estética de la planta, lo que al final afecta su exportación. Además, la presencia de nematodos fitoparásitos puede afectar de manera directa en las relaciones de exportación con mercados exigentes como el de Estados Unidos, principal destino de estos productos (Barahona et al., 2011).

En Costa Rica, la identificación de nematodos del género Meloidogyne y otros fitonematodos se realiza usualmente a nivel de género, principalmente por la complejidad morfológica y alta inversión de tiempo, y en algunos casos falta mayor calificación del personal (Hyman, 1990; Powers y Harris, 1993; Orui, 1999; Salazar-Antón y Guzmán-Hernández, 2013b). En vista de lo anterior, resulta necesario, que además del aislamiento de juveniles, se aisle hembras (visibles en la fase final del ciclo de infección) para análisis morfológicos y morfométricos. En respuesta a esta problemática, se han implementado técnicas moleculares que facilitan el proceso de identificación (Hyman, 1990; Powers y Harris, 1993; Orui, 1999; Zijlstra, 2000; Powers et al., 2005; Subbotin y Moens, 2006; Flores, 2008; Powers et al., 2009). Sin embargo, cuando se busca una identificación certera, una técnica no es excluyente de la otra, sino, que son complementarias, debido a que un solo parámetro no es suficiente para determinar de forma definitiva la presencia de una especie. El traslape de medidas entre especies del género y la complejidad morfológica dificultan el diagnóstico, por ende resulta necesario implementar técnicas moleculares que, mediante el uso de otro tipo de informacion (ADN), permitan la separación entre especies. Una versión preliminar de esta investigación (Solano-González et al., 2011), evidenció la necesidad de evaluar varios criterios para poder distinguir nuevas especies que podrían ser identificadas en Costa Rica.

La técnica de Reacción de Cadena de la Polimerasa, mediante Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (PCR-RFLP), comprende la técnica convencional de PCR junto con el uso de enzimas de restricción posterior a la amplificación. De forma general, esta técnica amplifica un fragmento específico del genoma del individuo y utiliza enzimas de restricción para generar cortes en los fragmentos amplificados; los tamaños generados por estos cortes se comparan con aquellos reportados en la literatura y resulta un sistema altamente efectivo para el proceso de identificación (Powers y Harris, 1993; Powers et al., 2005; Flores, 2008). Una de las regiones más utilizadas para la identificación molecular de Meloidogyne se encuentra entre los genes mitocondriales 16S del ARNr y la subunidad II del citocromo oxidasa (COII) (Powers y Harris, 1993; Jeyaprakash et al., 2006; Humphreys et al., 2011; Maleita et al., 2012a, 2012b). Esta región ayuda a distinguir algunas de las principales especies de Meloidogyne de importancia agrícola (Powers, 2004).

El ADN para estas amplificaciones se puede obtener de dos formas: recolectando un grupo de hembras (usualmente cincuenta individuos) por disección de raíces infectadas, o extrayendo el material genético a partir de juveniles en segundo estado (J2), recolectados de muestras de suelo o raíz.

La presente investigación emplea un único individuo (J2) para llevar a cabo el objetivo de identificar especies de nematodos del género Meloidogyne asociadas a plantas ornamentales de altura.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo y aislamiento de nematodos. Los muestreos de suelo y raíz se realizaron en el vivero de plantas ornamentales “El Zamorano”, ubicado en el cantón de San Isidro de Heredia, Costa Rica (latitud 10°01´59”N y longitud 84°02´41”W) a una altura de 1360 msnm. Este sitio presentó una temperatura máxima de 25 °C y mínima de 16 °C, con una precipitación anual de 1500 a 2000 mm durante el tiempo de estudio. Los muestreos se efectuaron entre el año 2011 y el 2012 tanto en época seca, como en época lluviosa. Se seleccionaron diez especies de plantas ornamentales susceptibles al ataque de Meloidogyne: Abelia sp., Duranta sp., Allium sp., Begonia sp., Impatiens sp., Gardenia sp., Ficus pumila, Lantana camara, Calathea sp. y Rosa sp. (Brito et al., 2010). Se implementó un plan sistemático de muestreo en zig-zag para cada una de las plantas ornamentales seleccionadas. Algunas de estas estaban sembradas en campo mientras que otras en macetas (Begonia sp., Impatiens sp. y Calathea). Se tomaron dos submuestras de suelo y raíz por cultivo a una profundidad de 30 cm, para generar una muestra compuesta (suelo y raíz individualmente) por especie de planta ornamental.
Las muestras se trasladaron al Laboratorio de Nematología de la Escuela de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional (UNA).

El aislamiento de hembras ovígeras se realizó mediante la disección manual de raíces agalladas. La extracción de segundos estadios juveniles (J2) se hizo con el método de centrifugación-flotación en solución azucarada para las muestras de suelo, y la técnica de macerado y centrifugación en solución azucarada para las muestras de raíz (Southey, 1965).

Análisis morfológico. Los nematodos recuperados se contaron y se identificaron empleando un microscopio invertido a 200X. Se utilizaron diez nematodos J2 por cultivo para las mediciones morfométricas y al menos seis hembras por cultivo para la obtención de los patrones perineales. Se utilizó como referencia la clave de identificación de nematodos noduladores de Jepson (1987). Se midieron los siguientes caracteres: longitud del estilete, tamaño de la cola y de la región hialina de la cola de los J2. Para los diseños perineales, las hembras se prepararon y depositaron en un portaobjetos para su posterior análisis. Se realizó un montaje temporal para juveniles y hembras en 16 µl de agua destilada y fueron fotografiados a 100X, utilizando un microscopio con una cámara fotográfica integrada.

Análisis molecular. La extracción de ADN se logró a partir de juveniles aislados individualmente, que fueron depositados en 16 µl de agua ultra pura sobre un portaobjetos y fueron macerados con una puntilla de pipeta. Cada individuo se almacenó a -20 ºC para los posteriores análisis moleculares.

Se utilizaron las secuencias de dos imprimadores C2F3 (´5-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3´) y 1108 (´5-TACCTTTGACCAATCACGCT-3´) detalladas por Powers y Harris (1993). Para la PCR, se usó un volumen final de 25 µl con una concentración final de 0,8 µM de cada imprimador, buffer de PCR a 1X, MgCl2 a 3,0 mM, 0,08 mM de cada dNTP, dos unidades de ADN polimerasa y 15 µl del ADN obtenido a partir de un J2 de Meloidogyne. La reacción de amplificación se llevó a cabo en un termociclador de punto final de 96 pozos en el Laboratorio de Biología Molecular de la Escuela de Ciencias Agrarias de la UNA.

Las condiciones del perfil térmico fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 94 °C durante dos minutos, seguidamente diez ciclos de: 94 °C por diez segundos, 48 °C por treinta segundos, 68 °C por dos minutos. Se continuó con veinticinco ciclos de: 94 °C de diez segundos, 48 °C por treinta segundos y 68 °C por dos minutos con un delta de +20 por cada ciclo consecutivo en el paso de extensión. Las reacciones finalizaron con una extensión final de 72 °C de dos minutos (Jeyaprakash et al., 2006).

Los productos de PCR fueron evaluados en un gel de agarosa al 1% con buffer TBE al 1X y se corrieron en una cámara de electroforesis comercial durante 90 minutos a 90V a un amperaje constante de 250-300 mA. Se utilizaron marcadores de peso molecular de 100 pb y 50 pb. Posteriormente, el gel fue teñido con un colorante comercial. Para las restricciones enzimáticas, se emplearon las enzimas DraI, HinfI y AluI. El tiempo de incubación fue de dos a cuatro horas a 37 °C, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Al finalizar la digestión, se evaluaron nuevamente los productos en geles de agarosa al 2%. Estos fueron teñidos como se mencionó anteriormente y se utilizaron marcadores de peso molecular de 100 pb y 50 pb. Las fotografías de las digestiones y productos de PCR fueron digitalizadas con un fotodocumentador para comparar los patrones de bandas generados con otros previamente reportados en la literatura.

El nematodo aislado de F. pumila fue analizado por medio de secuenciación capilar con colaboración del Instituto de Agricultura Sostenible, España. Se utilizaron los imprimadores D2D3 e ITS (Hugall et al., 1999; Castillo et al., 2009). El proceso de secuenciación se aplicó únicamente a este aislamiento, debido a que los patrones generados no coincidían con los reportados en la literatura.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis morfológico. Los estudios morfométricos de juveniles y diseños perineales de hembras permitió la identificación de tres de las especies encontradas en este estudio: M. javanica, M. hapla y M. arenaria (Cuadro 1, Figura 1). M. javanica se encontró en el cultivo de Gardenia sp., este presentó líneas laterales definidas que separan las estrías dorsales de las ventrales. Con respecto a M. hapla, fue identificada en el cultivo de Rosa sp., y presentó una región en forma de hexágono redondeado a ovalado y la presencia de puntuaciones en el término de la cola. Para la especie M. arenaria aislada de Calathea sp., se logró identificar la presencia de un arco dorsal, presentó estrías con ondulaciones pronunciadas que se proyectaron a partir de las tenues líneas laterales. Sin embargo, la variabilidad intraespecífica en los patrones perineales de los nematodos en las muestras de Begonia sp., Impatiens sp., y Ficus pumila, no permitió una identificación certera a nivel de especie mediante el patrón perineal.

Fue notable la dificultad taxonómica para la identificación del género Meloidogyne, lo que ha sido denotado por otros autores (Hirschmann, 1986; Jepson, 1987; Maleita et al., 2012b). Sin embargo, aun cuando no fue posible esclarecer todas las especies asociadas a cada ornamental mediante morfología y morfometría, se logró identificar cuatro de las principales especies de este género, tomando en cuenta que solo se incluyeron tres criterios morfométricos y uno morfológico.

Análisis molecular. Los productos de PCR obtenidos en este estudio (Cuadro 2), concuerdan con otros estudios reportados (Powers y Harris, 1993; Blok et al., 2002; Powers et al., 2005; Flores, 2008; Humphrey et al., 2011). El producto inicial de PCR de menor tamaño lo presentó el aislamiento de Rosa sp; mientras que los fragmentos de mayor tamaño fueron los reportados para los aislamientos de F. pumilla, Gardenia sp. y Allium sp. Los demás aislamientos se mantuvieron en el valor de 1,1 kb o 1,5 kb. Tras la digestión con la enzima HinfI se generaron fragmentos en el rango de 500 a 1250 pb; la enzima AluI generó fragmentos de menor tamaño, entre el rango de 200 a 900 pb, a excepción de dos fragmentos mayores a 1 kb. La enzima DraI fue la que generó la menor cantidad de cortes, únicamente para tres aislamientos diferentes. Este método permitió distinguir cinco especies de nematodos de forma precisa.

Las especies M. javanica y M. incognita, ambas con productos de PCR de 1,5 kb, se lograron diferenciar entre sí mediante las enzimas HinfI y AluI. Para M. javanica no hubo corte con la enzima HinfI, lo cual mantiene consistencia con lo reportado por otros autores que sugieren la ausencia del sitio de restricción en esta especie (Blok et al., 2002). Además, se obtuvieron patrones de digestión con la enzima AluI que no han sido reportados anteriormente para M. javanica. Para esta digestión, los fragmentos obtenidos con ambas enzimas, también mantuvieron relación con valores previamente reportados de esta especie (Blok et al., 2002; Powers et al., 2005; Flores, 2008; Peraza-Padilla et al., 2013).

Las especies denominadas como Meloidogyne sp. (Cuadro 2), no concordaron con valores previamente reportados tras las digestiones enzimáticas. No obstante, tras la incubación con la enzima AluI presentaron similitud a los patrones de banda generados por las especies M. incognita y M. javanica. Un único aislamiento de Meloidogyne sp. fue incubado con la enzima DraI y generó patrones de banda muy similares a M. javanica. Debido a la amplitud del género y al poco conocimiento de esta especie en ecosistemas tropicales (Brito et al., 2007), estas diferencias podrían atribuirse a subespecies no reportadas.

El aislamiento a partir de F. pumila generó el producto de PCR más largo (1,7 kb), similar al reportado por Maleita et al. (2012b) y tras la digestión con la enzima HinfI, generó un fragmento de 800 pb que coincidió con los hallazgos de Cenis et al. (1992), ambos estudios referentes a la identificación de M. hispanica. Según los resultados de secuenciación, se obtuvo un 99% de similitud con M. hispanica. Maleita et al. (2012b) reportan fragmentos de 1000, 580 y 240 pb para M. hispanica tras digestión del producto con AluI. Sin embargo, en este estudio se obtuvieron fragmentos de 1250 y 450 pb (Figura 2). Los datos morfométricos de la longitud del estilete de este estudio concuerdan con los valores reportados por Hirschmann (1986) y Maleita et al. (2012b) pero no con los valores reportados por Jepson (1987) para M. hispanica. Por otra parte, las mediciones morfométricas de la región hialina y longitud de la cola sí se encuentran dentro del rango reportado de variación de la especie indicado por Jepson (1987).

La presencia de M. hispanica asociada al cultivo de F. pumila es un dato preliminar que no ha sido reportado anteriormente para Costa Rica. No obstante, es necesario efectuar más estudios al respect, puesto que no hay concordancia con algunos de los fragmentos generados por el PCR-RFLP. Este nematodo también ha sido asociado al género Ficus en Brasil (Maleita et al., 2012a, 2012b), donde predominan condiciones climáticas similares a las de Costa Rica.

Identificación de especies. No fue posible identificar, a nivel de especie, los aislamientos de Meloidogyne sp. provenientes de los cultivos de Begonia sp., Impatiens sp. y Gardenia sp., debido al vacío de información existente. Aun cuando se generaron patrones de restricción, no existe en la literatura otros aislamientos con los cuales comparar, lo que denota la necesidad de generar más estudios que ayuden a correlacionar este tipo de análisis e información. Ejemplo de esto fue el aislamiento de Gardenia sp. que mediante análisis molecular no fue posible determinar la especie asociada y se determina como Meloidogyne sp., en el Cuadro 2, pero mediante el patrón perineal se asoció a M. javanica.

Además de la metodología de Power y Harris (1993), se han diseñado imprimadores específicos para las principales especies representantes del género Meloidogyne (Zijlstra, 2000; Zijlstra et al., 2000), mediante la técnica RAPD y SCAR. Estos fueron probados en este estudio, pero en ninguno de los casos se obtuvieron resultados. Amplificaciones fallidas al utilizar los imprimadores específicos para M. incognita fueron obtenidas por Adam et al. (2007), lo que demuestra que no en todos los casos los imprimadores específicos de especie resultan una herramienta consistente de diagnóstico.

En este estudio se utilizó un único individuo para la extracción y amplificación de ADN, ya que es de mayor utilidad en términos prácticos. Aunque, esta práctica no es común debido a la dificultad de repetir los resultados, se generaron productos de PCR distinguibles a partir de un único individuo (J2). Además, los resultados fueron repetibles en todos los casos. En la gran mayoría de los estudios se utiliza un pool de hembras (usualmente cincuenta), para asegurar el procedimiento de PCR (Powers y Harris, 1993; Orui, 1999, Zijlstra, 2000; Powers et al., 2005; Subbotin y Moens, 2006; Flores, 2008; Powers et al., 2009; Humphreys et al., 2011).

El diagnóstico molecular del ADN mitocondrial de J2 aislados de Allium sp. permitió determinar la identidad de M. incognita, también reportado en otros estudios (Quénéhervé et al., 2011). Un caso particular fue el cultivo de Begonia sp., en el cual no fue posible determinar la especie de nematodo asociada mediante ninguno de los dos métodos utilizados. Otros estudios confirman la presencia de M. incognita y M. arenaria como nematodos noduladores asociados (Brito et al., 2010). La integración de los métodos de diagnóstico taxonómico y molecular (ADN mit) permitieron confirmar la identidad de M. hapla en Rosa sp.; estos resultados concuerdan con lo informado por otros investigadores (Ortuño y Oros, 2002; Gandarilla, 2005; Levin, 2005). Para el caso de Gardenia sp., se determinó la especie M. javanica como nematodo asociado, aunque también existen reportes de otras especies del género relacionadas a este cultivo (Richardson y Grewal, 1993; Gandarilla, 2005; Brito et al., 2010). Otro caso en el que los métodos de identificación taxonómica y molecular permitieron llegar al mismo resultado fue para el cultivo Calathea sp., en el cual se encontró la especie M. arenaria.

Además de lograr identificar la gran mayoría de individuos encontrados en diez plantas ornamentales, se reportaron los patrones de restricción con la enzima AluI para M. hapla y M. javanica que no habían sido indicados anteriormente. Aunado a esto, se obtuvo el primer reporte de la presencia de M. hispanica en Costa Rica.

Se logró identificar un total de cinco especies de nematodos del género Meloidogyne mediante la técnica de PCR-RFLP y se generó un total de vientitrés bandas entre todos los J2 aislados de los diez cultivos seleccionados. También se determinó que la enzima más informativa fue AluI ya que produjo la mayor cantidad de patrones de bandas para todas las muestras evaluadas, para un total de once; la enzima DraI produjo solo cuatro bandas. Sin embargo, esta última endonucleasa no se utilizó en todos los casos porque los patrones de interés para esta investigación resultaron exclusivos para determinar la especie M. hapla. No obstante, también se utilizó en varias Meloidogyne spp.

Este estudio establece los precedentes para la incorporación de esta metodología en análisis de diagnóstico molecular; así como el reporte preliminar de la presencia de una especie nueva para Costa Rica, M. hispanica. Este tipo de datos brindan una alerta al Sistema Fitosanitario Nacional (SFN) sobre las regulaciones de ingreso de organismos vegetales al país; así como la gran necesidad de generar más estudios en el área, debido al vacío existente en ecosistemas tropicales y a la existencia de una gran variedad de especies de nematodos nodulares.

En Costa Rica, el documento oficial emitido por el SFN declara la ausencia de Meloidogyne como plagas reglamentarias en el país; no obstante, es importante revisar constantemente este estatus (MAG, 2012), debido a la importación y exportación de diversos productos, entre estos las plantas ornamentales, lo que favorece a la transferencia de plagas de un sitio a otro. Posiblemente, este pudo ser el mecanismo de entrada de M. hispanica en Costa Rica; por ende tal información resulta de gran provecho para los productores nacionales, pues se les facilita el acceso a pruebas de diagnóstico y se les da la posibilidad de corregir a tiempo cualquier posible infección de sus cultivos por Meloidogyne.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean expresar su agradecimiento a Walter Peraza por la gran ayuda con las fotografías y la revisión del manuscrito, y a Irena Hilje por su colaboración en los ensayos de laboratorio. A Pablo Castillo del CSIC, España por los análisis de secuenciación. La Fundación CRUSA-CSIC que financió el proyecto “Diagnóstico y caracterización bioquímica y molecular de nematodos noduladores (Meloidogyne spp.) en cultivos tropicales y hortícolas de Costa Rica”.

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