Agron. Mesoam. 29(3):673-694. Setiembre-diciembre, 2018

ISSN 2215-3608, doi:10.15517/ma.v29i3.29832

http://www.revistas.ucr.ac.cr/index.php/agromeso

Revisión bibliográfica

Compilación de oligonucleótidos para la detección y clasificación de fitoplasmas1

Compilation of primers for the detection and classification of phytoplasmas

Karina Araujo-Ruiz2, José Manuel Cambrón-Crisantos2, José Luis Cruz-Jaramillo3, Liliana Elizabeth Ronces-Frutos2, José Abel López-Buenfil2, José Gustavo Torres-Martínez2

Resumen

Los fitoplasmas son procariontes fitopatógenos de gran importancia, debido a que han sido relacionados con numerosas enfermedades alrededor del mundo. El objetivo de esta investigación fue dar a conocer los avances que se tienen sobre las características generales, el tamaño y composición del genoma y los genes y/o regiones empleados como marcadores moleculares para la identificación y caracterización de los fitoplasmas. Entre sus principales hospederos se encuentran los árboles frutales y maderables, hortalizas, flores de corte y malezas, en los cuales generan alteraciones en el equilibrio hormonal, produciendo síntomas como filodias y virescencias. Debido a que no ha sido posible su aislamiento in vitro, estos se han identificado, principalmente, mediante técnicas moleculares. Aunado a esto, el uso de la Secuenciación de Nueva Generación (NGS) ha permitido conocer el genoma completo de algunos fitoplasmas, así como las regiones y genes que lo constituyen. En la presente revisión bibliográfica, se recopila la información generada a partir de las técnicas moleculares y la secuenciación NGS, así como los oligonucleótidos reportados para identificar algunos grupos de fitoplasmas.

Palabras clave: Mollicute, Candidatus, genoma, PCR.

Abstract

Phytoplasmas are phytopathogenic prokaryotes of great importance because they have been linked to numerous diseases around the world. The aim of these research was to present the general characteristics, the size and composition of the genome and the genes and/or regions used as molecular markers for the identification and characterization of phytoplasmas. Among its main hosts are fruit and wood trees, vegetables, cut flowers and weeds, which generate alterations in the hormonal balance producing symptoms such as philodias and virescence. Because its isolation in vitro has not been possible, the detection and characterization has been carried out, mainly, with molecular techniques. In addition, the use of New Generation Sequencing (NGS) has allowed to know the complete genome of some phytoplasmas, as well as the regions and genes that constitute it. In the present bibliographic review, the information generated from the molecular techniques and NGS sequencing is compiled, as well as the primers reported to identify some groups of phytoplasmas.

Keywords: Mollicute, Candidatus, genome, PCR.

1 Recibido: 27 de julio, 2017. Aceptado: 9 de enero, 2018. Este trabajo formó parte de las actividales de referencia fitosanitaria, desarrolladas por el Área de Desarrollo y Validación de Protocolos del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria. México.

2 Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria. Km 37.5 Carretera Federal México – Pachuca, Tecámac, Edo. de México, C.P. 55740, México. karina.araujo@senasica.gob.mx (autor para correspondencia), dgsv.iica061@senasica.gob.mx, dgsv.cnrfito14@senasica.gob.mx, leliz.ron.fru@gmail.com, abel.lopez@senasica.gob.mx, gustavo.torres@senasica.gob.mx

3 Instituto Politécnico Nacional, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados. Av Instituto Politécnico Nacional 2508, La Laguna Ticoman, 07360 Ciudad de México, México. lcruz@cinvestav.mx

Introducción

Los fitoplasmas son bacterias endófitas con formas pleomórficas, que poseen un tamaño variable desde 50 hasta 1000 nm de diámetro. Se ha sugerido que su propagación es llevada a cabo mediante fisión binaria, siendo capaces de una replicación autónoma (Doi et al., 1967; Oshima et al., 2004).

Inicialmente los fitoplasmas fueron catalogados como organismos cercanamente relacionados a los micoplasmas, debido a la similitud morfológica con los micoplasmas que infectan animales y a su sensibilidad a los antibióticos de la familia de las Tetraciclinas (Ishiie et al., 1967). Sin embargo, difieren sustancialmente de ellos, debido a caracteres morfológicos como la ausencia de pared celular y a sus características moleculares como homología (97,5%) con el gen ribosomal 16S (16Sr) y bajo contenido de Guanina (G) y Citosina (C). Taxonómicamente se encuentran dentro de la clase Mollicutes, donde también se encuentran los micoplasmas, ureplasmas, spiroplasmas y acholeplasmas (Razin et al., 1998). Estos procariontes han sido agrupados dentro de la categoría Candidatus, donde son referenciados todos aquellos organismos que no han podido ser cultivados en medios artificiales (in vitro) (Reveles-Torres et al., 2014). Por esta razón, a partir de 2004 el nombre científico para referirse a los fitoplasmas quedó establecido como “Candidatus Phytoplasma” (The IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team – Phytoplasma taxonomy group, 2004).

El rango de hospedantes de los fitoplasmas incluye por lo menos 1000 especies de plantas alrededor del mundo, en su mayoría dicotiledóneas (Seemüller et al., 2002), incluyendo hortalizas, árboles frutales y maderables, flores de corte y malezas (Lee et al., 2000; Hogenhout y Music, 2010; Tan et al., 2016). Estos fitopatógenos se caracterizan por colonizar el floema de las plantas, donde residen y se multiplican, alterando el balance de fitohormonas. Como resultado de estas alteraciones, se observan sintomatologías como enanismos, amarillamientos, proliferación de yemas, ramas, hojas y raíz (sintomatología conocida como “escoba de bruja”), virescencia (pétalos florales verdes) y filodias (conversión de flores a hojas). Además, producen elongación de hojas, esterilidad de flores, elongación anormal de entrenudos, brotes delgados y acucharamiento de hojas. Adicionalmente, los fitoplasmas están asociados con muchos otros síntomas inespecíficos; sin embargo, estos pueden ser resultado de la tensión a la que se somete la planta huésped por la infección (Lee et al., 1998a; Bertaccini, 2007).

Una de las enfermedades causadas por los fitoplasmas con mayor impacto económico es el “Amarillamiento letal del Cocotero”, la cual es ocasionada por fitoplasmas del grupo 16SrIV. Esta enfermedad ha causado grandes pérdidas económicas y, actualmente se encuentra distribuida en el continente americano, africano y asiático (Mpunami et al., 1999; Harrison et al., 2002; Harrison et al., 2014). Por otra parte, se han registrado pérdidas económicas en el cultivo de papa a causa del fitoplasma ‘Ca. Phytoplasma trifolii’ [16SrVI-A], que ocasiona síntomas de escobas de bruja en la raíz, impidiendo el flujo de nutrientes y el correcto desarrollo del tubérculo (Bertaccini y Duduk, 2009). Los cultivos de maíz de las zonas del centro y sur de América reportaron bajo rendimiento de la planta, debido al enanismo arbustivo y al amarillamiento, producidos por el fitoplasma ‘Ca. Phytoplasma asteris’ [16Srl-B] (Bedendo et al., 2000; Bertaccini y Duduk, 2009).

Los fitoplasmas son simbiontes en plantas y en algunos insectos, principalmente del orden Hemiptera como los de la familia Fulgoridae, Cicadellidae, Delphacidae, Derbidae y Flatidae comúnmente llamados “chicharritas”, aunque algunos psílidos (Familia Psyllidae) y saltamontes (Familia Acrididae) también se comportan como vectores después de alimentarse del floema de las plantas infectadas (Bertaccini, 2007).

Debido a la incapacidad de cultivar a los fitoplasmas de manera in vitro, los caracteres fenotípicos para su identificación y clasificación han sido difíciles de determinar. Tradicionalmente, el diagnóstico de fitoplasmas se hacía a partir de la caracterización de los síntomas y la observación mediante microscopia electrónica (Doi et al., 1967). Sin embargo, con la implementación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction), la PCR anidada, así como los perfiles de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP por las siglas en inglés de Restriction Fragment Length Polymorphism) en el gen ribosomal 16S, se estableció un sistema de clasificación a partir de la generación de patrones polimórficos, para diferenciar a los fitoplasmas en grupos y subgrupos (Lee et al., 1998b).

Actualmente, se han identificado nuevos fitoplasmas que no cumplen con el criterio de agrupación propuesto por Lee et al. (1998b), debido a variaciones heterogéneas en sus secuencias y a la generación de nuevos perfiles polimórficos. No obstante, se han propuesto nuevos criterios de clasificación con base en la información disponible de las regiones y genes alternativos al marcador 16SrRNA, lo que ha permitido ubicar regiones específicas para el diseño de oligonucleótidos que coadyuvan en su identificación y clasificación (Hodgetts et al., 2008). La caracterización del genoma de varios fitoplasmas a través de la Secuenciación de Nueva Generación (NGS, por las siglas en inglés de New Generation Sequencing) ha permitido tener un panorama más amplio de su composición y conocer las relaciones evolutivas entre grupos de fitoplasmas y clases de Mollicutes (Bai et al., 2004; Gasparich, 2010).

El objetivo de esta investigación fue dar a conocer los avances que se tienen sobre las características generales, el tamaño y composición del genoma y los genes y/o regiones empleados como marcadores moleculares para la identificación y caracterización de los fitoplasmas.

Genoma de los fitoplasmas

Tamaño y composición

El contenido porcentual de G + C en el ADN cromosómico de los fitoplasmas se encuentra estimado entre el 23 y el 29%. Este porcentaje es una característica de afiliación filogenética de los fitoplasmas con respecto a los miembros de la clase Mollicutes, ya que al igual que estos, los fitoplasmas contienen una molécula de ADN cromosómica circular de doble cadena y un conjunto limitado de enzimas metabólicas (Neimark y Kirkpatrick, 1993; Tran-Nguyen et al., 2008). Contienen alrededor de 300 y 900 genes en su genoma y a diferencia de los micoplasmas, los fitoplasmas utilizan diferentes mecanismos de recombinación para adaptarse a los entornos de plantas e insectos, volviéndose dependientes de la asimilación de nutrientes por parte del hospedero (Bai et al., 2006).

Las características genómicas de los fitoplasmas se han determinado mediante purificaciones o soluciones enriquecidas a partir de plantas infectadas o vectores, mediante irradiación gama y electroforesis en gel por campo pulsado (Lee et al., 2000).

Recientemente, con la adopción de las plataformas NGS y de tecnologías que facilitan el análisis bioinformático de la información generada, se han publicado los genomas completos de algunos fitoplasmas y se tiene un mayor conocimiento de su tamaño y composición, así como del contenido de proteínas, ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosomales (ARNr), número de genes presentes y las vías metabólicas con las que cuentan (Cuadro 1) (Saccardo et al., 2012).

Cuadro 1. Características generales de los genomas de fitoplasmas publicados en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) a partir del año 2003 al 2017. Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), México, 2017.

Table 1. General characteristics of phytoplasmas genomes published in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) from 2003 to 2017. National Center of Phytosanitary Reference (CNRF), Mexico, 2017.

Se estima que el tamaño genómico de los fitoplasmas se encuentra en un rango de 0,35 a 0,88 Mbp. En los Mollicutes cultivables, dicho rango varía entre <0,60 a 2,20 Mbp, en los Mycoplasma spp., los tamaños de genoma oscilan entre 0,58 hasta 1,38 Mbp. Los Spiroplasma spp. poseen un intervalo aún mayor de 2,20 a 7,80 Mbp. En el género Acholeplasma, el rango de tamaño en el genoma es más estrecho, variando entre 1,50 y 1,65 Mbp (Razin et al., 1998; Marcone et al., 1999; Gasparich, 2010).

El análisis comparativo de la información genómica de los fitoplasmas, evidenció que su ADN se organiza en grandes grupos de Unidades Móviles Potenciales (PMUs, por sus siglas en inglés), los cuales contienen Secuencias de Inserción (IS, por las siglas en inglés de Insertion Sequences) de distintos genes conservados, incluyendo los genes de recombinación (tra5, ssb, himA) y replicación (dnaG, dnaB), lo que sugiere que las PMU son transposones compuestos replicativos (Bai et al., 2006).

El genoma de los fitoplasmas codifica un menor número de proteínas con funciones metabólicas en comparación con los genomas de algunos micoplasmas, como la ausencia del ciclo de las pentosas fosfato y la inexistencia de las subunidades de la ATPsintasa, que se creían esenciales para la vida (Oshima et al., 2004). Esto puede ser resultado de una evolución reductiva, como consecuencia de una vida como parásitos intracelulares en un ambiente rico en nutrientes. Además, poseen proteínas de membrana que, hasta el momento, se cree que son exclusivas de los fitoplasmas (Hongenhout y Music, 2010).

Genomas publicados

Entre las secuencias de genomas publicadas se encuentran “Ca. Phytoplasma onion yellows OY-M” [16SrI] (Oshima et al., 2002) con un tamaño de 0,85 Mbp, “Aster yellows witches’-broom phytoplasma” (AY-WB) [16SrI] con 0,71 Mbp (Bai et al., 2006) y “Ca. Phytoplasma asteris” [16SrI] con 0,6 Mbp (Zhu et al., 2017). Aunque estos fitoplasmas se encuentran clasificados dentro del grupo 16SrI por los perfiles enzimáticos que presentan, poseen diferencias genómicas, ya que AY-WB es 0,14 Mbp más pequeño que el genoma de OY-M como resultado de un menor número de secuencias múltiples dentro de su genoma, incluyendo PMUs.

El genoma de “Ca. Phytoplasma australiense” (subgrupo tuf-Australia I; rp-A) [16SrXII-B], fue descrito por Tran-Nguyen et al. (2008), quienes además realizaron un análisis comparativo entre este y OY-M y AY-WB. Los resultados mostraron que “Ca. Phytoplasma australiense” posee un cromosoma más grande (18,693 pb más que OY-M), así como un mayor número de genes con función asignada y la presencia de un mayor número de proteínas reportadas con función desconocida con respecto a los dos genomas anteriormente obtenidos, por lo que, ahora se conoce que los fitoplasmas se someten a una evolución rápida en su genoma como consecuencia de su ciclo de vida (Tran-Nguyen et al., 2008).

Se ha reportado un tamaño de 0,6 Mbp en el genoma de “Ca. Phytoplasma mali” [16SrX], con un contenido de G + C de 21,4%, así como limitadas capacidades metabólicas que reflejan características hasta el momento únicas de este fitoplasma (Kube et al., 2008) (Cuadro 1). En comparación con los genomas que incluye el grupo 16SrI (AY-WB y OY-M) y “Ca. P. australiense”, “Ca. P mali” tiene un menor número de genes parálogos que permiten acumular mutaciones sin que el individuo pierda las funciones de dicho gen, generando nuevas proteínas con función similar y un menor número de inserciones de posibles elementos móviles de ADN, además de poseer un conjunto de genes de recombinación homóloga (Kube et al., 2008).

Otros genomas de fitoplasmas han sido secuenciados y publicados, entre los que se encuentran, el genoma de “Ca. Phytoplasma pruni” [16SrIII] (Saccardo et al., 2012), el de “Ca. Phytoplasma phoenicium” [16SrIX] que, hasta el momento, es el genoma reportado más pequeño con 0,35 Mbp (Quaglino et al., 2015), y recientemente el genoma de “Ca. Phytoplasma aurantifolia” [16SrII] con 0,47 Mbp (Foissac y Carle, 2017) (Cuadro 1).

Marcadores genéticos

Distintas regiones, genes y proteínas, se han empleado como marcadores en la identificación de los fitoplasmas, incluyendo el gen 16SrRNA, el factor de elongación de la traducción (tuf), la proteína de la subunidad translocasa Y (secY) (Foissac et al., 2013), proteínas en el operon ribosomal (rp) (Martini et al., 2007), el espacio intergénico (IGS) entre 16S–23S (Smart et al., 1996), la proteína de la subunidad translocasa A (secA), genes no ribosomales como map y pnp, así como los genes que codifican las proteínas de superficie variables: vmp1 (Cimerman et al., 2009), imp (Kakizawa et al., 2006b), amp (Kakizawa et al., 2006a), stamp (Fabre et al., 2011), groEL (Mitrović et al., 2011) y hflB (Seemüller y Schneider, 2007).

Los genes nusA, PNPase, Ata, el factor vinculante de cmp (CBF) y otros genes han sido identificados por medio de la secuenciación del genoma de Aster yellows witches’-broom phytoplasma (AY-WB) [16SrI] (Bai et al., 2004).

Clasificación de los fitoplasmas

Uno de los métodos más comunes para la identificación de los fitoplasmas es el propuesto por Lee et al. (1998b), el cual consiste en una PCR anidada con el empleo de dos pares de oligonucleótidos basados en la región 16SrRNA. El producto final es digerido con enzimas de restricción mediante la técnica de RFLP, y los patrones resultantes de la digestión enzimática son comparados con lo reportado por el mismo autor. Sin embargo, algunos grupos de fitoplasmas comparten un mismo patrón de bandeo durante el análisis enzimático por RFLP, por lo que, esta técnica resulta inapropiada para una diferenciación más fina de fitoplasmas (Marcone et al., 2000; Foissac et al., 2013).

Si bien la clasificación enzimática realizada por Lee et al. (1998b) fue el antecedente para la clasificación de los fitoplasmas, el uso de otros genes y regiones independientes al 16Sr han permitido establecer relaciones evolutivas y proponer nuevas clasificaciones, incluso de grupos específicos. Tal es el caso del gen secY que ha proporcionado una subdivisión más detallada del grupo 16SrI “Aster yellows”, al encontrar diferencias entre muestras del mismo grupo, dando lugar a diez linajes genéticamente distintos con respecto a 16Sr (Lee et al., 2006). Por su parte, Marcone et al., (2000) clasificaron al mismo grupo con el análisis filogenético de secuencias basadas en el gen tuf.

Un análisis filogenético, con secuencias del gen 23S y secA, fue presentado por Hodgetts et al. (2008) como una alternativa molecular para diferenciar distintos grupos y subgrupos de fitoplasmas, esto a pesar de que secA se encuentra disponible en una sola copia en el genoma de fitoplasmas. Además, examinaron las relaciones evolutivas entre grupos específicos previamente clasificados mediante 16SrRNA. Por su parte, Martini et al. (2007) también clasificaron filogenéticamente distintos grupos de fitoplasmas, basándose en dos genes de la proteína ribosomal (rp), rplV (rpl22) y rpsC (rps3). Además, añadieron al análisis filogenético la comparación con otros Mollicutes y bacterias Gram positivas con el fin de evaluar la eficacia de los genes empleados, teniendo buenos resultados y una diferenciación más detallada con respecto al 16Sr.

Actualmente, existen herramientas virtuales que permiten generar simulaciones de experimentos basados en biología molecular de manera In silico. Tal es el caso de la plataforma iPhyClassifier, que permite clasificar a los fitoplasmas teniendo como base una secuencia de interés, con la cual se genera un gel virtual donde son observados los patrones enzimáticos dependiendo de la enzima seleccionada (Zhao et al., 2009).

Otra forma de identificar y clasificar a los fitoplasmas es mediante un análisis bioinformático, realizando agrupaciones filogenéticas de secuencias (Wei et al., 2007) o por comparación con respecto a las secuencias depositadas en el NCBI (Benson et al., 2013).

Técnicas de identificación

Inicialmente la identificación de fitoplasmas se realizó mediante técnicas como Western Blot, hidrólisis de ADN, separación mediante centrifugación, Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, por las siglas en inglés de High Performance Liquid Chromatography), hibridación, entre otras (Kollar y Seemüller, 1989). Sin embargo, la inclusión de la técnica de PCR y de sus variantes han permitido complementar su diagnóstico, además de corroborar, cuantificar e incluso identificar nuevos fitoplasmas (Torres et al., 2005; Obura et al., 2011; Pérez-López et al., 2017).

PCR convencional

La especificidad de la PCR deriva del diseño de los oligonucleótidos, los cuales reconocen una secuencia específica que será amplificada por la enzima Taq polimerasa. Para tal motivo, se han diseñado oligonucleótidos a partir de distintas regiones, genes y proteínas, algunos diseñados para identificar la presencia o ausencia de los fitoplasmas denominados “oligonucleótidos generales”, y otros con secuencias específicas para determinados grupos y subgrupos denominados “oligonucleótidos específicos”. En el Cuadro 2 se presentan distintas secuencias de oligonucleótidos diseñados para PCR convencional que amplifican la región 16SrRNA. Posteriormente, se presentan los oligonucleótidos diseñados a partir de la región espaciadora (SR) entre 16S-23SrRNA (Cuadro 3), el factor de elongación de la traducción (tuf), genes de proteínas ribosómicas (rp) (Cuadro 4); finalmente, en el Cuadro 5 se presentan las secuencias de oligonucleótidos para los genes secY, secA, spc y uvrB.

Cuadro 2. Secuencias y características de oligonucleótidos para PCR convencional que amplifican la región 16S rRNA. Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), México, 2017.

Table 2. Sequences and characteristics of oligonucleotides for conventional PCR primers for the 16S rRNA region. Nacional Center of Phytosanitary Reference (CNRF), Mexico, 2017.

Cuadro 3. Secuencias y características de oligonucleótidos para PCR convencional que amplifican entre la región 16S rRNA y la región espaciadora (SR) 16S-23SrRNA. Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), México 2017.

Table 3. Sequences and characteristics of oligonucleotides for conventional PCR primers for the region between 16S rRNA and the 16S-23S rRNA Spacer Region (SR). Nacional Center of Phytosanitary Reference (CNRF), Mexico 2017.

Cuadro 4. Secuencias y características de oligonucleótidos para PCR convencional que amplifican el factor de elongación de la traducción (tuf) y genes de proteínas ribosómicas (rp). Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), México 2017.

Table 4. Sequences and characteristics of oligonucleotides for conventional PCR primers for the translation elongation factor (tuf) and ribosomal protein (rp) genes. Nacional Center of Phyotsanitary Reference (CNRF), Mexico 2017.

Cuadro 5. Secuencias y características de oligonucleótidos para PCR convencional que amplifican secuencias del gen secY, secA, spc y uvrB. Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), México, 2017.

Table 5. Sequences and characteristics of oligonucleotides for conventional PCR primers for the secY, secA, spc and uvrB gene. Nacional Center of Phytosanitary Reference (CNRF), Mexico, 2017.

PCR cuantitativa (qPCR)

La implementación de la qPCR ha permitido la eliminación del procesamiento post-PCR, debido a la utilización de sondas u oligonucleótidos fluorogénicos que permiten la detección cuantitativa de pequeñas cantidades de ADN en lapsos relativamente cortos, así como la visualización y el monitoreo de los productos de PCR a medida que se acumulan, es decir, en tiempo real. Para ello, se pueden utilizar diversos tipos de químicas de detección para monitorear los productos como las sondas de hidrólisis TaqMan® o el compuesto SYBR® Green, entre otros (Arya et al., 2005).

El uso de la qPCR para la detección de fitoplasmas se ha empleado en trabajos como los de Christensen et al. (2004), mostrando la detección y cuantificación de distintos grupos de fitoplasmas. El colorante fluorescente SYBR® Green I se ha empleado para la detección y cuantificación de “Ca. Phytoplasma pyri”, “Ca. Phytoplasma prunorum” y “Ca. Phytoplasma mali”, todos miembros del grupo 16SrX, diferenciándolos mediante curvas de cuantificación (Torres et al., 2005). Adicionalmente, otros grupos de fitoplasmas como 16SrI, 16SrV, 16SrX, 16SrXII y 16SrXII-A, entre otros, han sido detectados con esta técnica (Angelini et al., 2007; Bisognin et al., 2008; Galetto et al., 2005).

En el Cuadro 6 se presenta una lista de oligonucleótidos publicados para la técnica de qPCR.

Cuadro 6. Secuencias y características de oligonucleótidos y sondas para PCR cuantitativa (qPCR). Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), México, 2017.

Table 6. Sequences and characteristics of oligonucleotides for primers and probes for quantitative PCR (qPCR). Nacional Center of Phytosanitary Reference (CNRF), Mexico, 2017.

La qPCR también ha sido empleada para cuantificar la distribución y el flujo de los fitoplasmas en el floema de plantas afectadas, y reporta una infección desigual que depende del tipo y ciclo de vida de la planta huésped. Por ejemplo, en plantas leñosas se ha reportado una titulación baja con respecto a leguminosas (Galetto et al., 2005). Cabe señalar que, la qPCR es de gran utilidad en aquellos casos donde la concentración de fitoplasmas es baja, debido a que es una técnica sensible que permite detectar un número pequeño de copias de ADN, en comparación con la PCR convencional.

El análisis cuantitativo proporcionado por la qPCR ha ayudado en la identificación de distintos fitoplasmas que convergen en una misma planta, aunque no se ha esclarecido si las plantas que albergan diferentes concentraciones de fitoplasmas se comportan de manera diferente como fuente de inóculo para los vectores (Saracco et al., 2006; Danet et al., 2011).

Amplificación isotérmica (LAMP)

La técnica LAMP (siglas de Loop-mediated isothermal amplification) utiliza una ADN polimerasa desplazante de cadena (Bst), junto con dos pares de oligonucleótidos, unos externos y otros internos, además de un par de oligos opcionales llamados “bucle” o “loop”, que reconocen diferentes secuencias del ADN blanco y generan distintos productos de amplificación (Dickinson, 2015). Es una técnica sensible que permite la identificación visual de los resultados mediante fluorescencia, turbidez o curvas de detección, sin necesidad de un programa térmico como en la PCR convencional o qPCR. En este caso, la reacción se lleva a cabo en un bloque térmico a una temperatura fija, debido a las propiedades de la enzima termoestable Bst (Francois et al., 2011).

La amplificación isotérmica ha sido implementada en la detección de distintos organismos fitopatógenos, entre ellos bacterias como Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Yasuhara-Bell et al., 2015) y Candidatus Liberibacter solanacearum (Ravindran et al., 2012), virus como Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Fukata et al., 2003) y Potato virus Y (PVY) (Nie, 2005), nematodos como Meloidogyne enterolobii (Niu et al., 2012), entre otros.

En el caso de fitoplasmas, Hodgetts et al. (2011) reportaron la detección de distintos grupos (16SrI, 16SrII, 16SrIII, 16SrV, 16SrXI, 16SrXII y 16SrXXII), tomando los oligonucleótidos diseñados por Tomlinson et al. (2010) (Cuadro 7). Por otra parte, Obura et al. (2011) probaron la eficiencia y sensibilidad de la técnica al detectar los grupos de fitoplasmas 16SXI y 16SrIII con la amplificación isotérmica. El genoma publicado de “Ca. Phytoplasma onion yellows” (OY-M) (Oshima et al., 2004), fue utilizado por Sugawara et al. (2012) para el diseño de oligonucleótidos a partir del gen conservado groEL. La sensibilidad de la técnica, el espectro y la robustez de su estudio fueron probados a partir del diseño de diecinueve juegos de oligonucleótidos analizados en distintos grupos de fitoplasmas. Además, la técnica LAMP se propone como una herramienta para la detección del grupo 16SrV-C (Flavescence dorée), basada en la amplificación de la región 16SrRNA y la región 23SrRNA (Kogovšek et al., 2015) (Cuadro 7).

Cuadro 7. Secuencias y características de oligonucleótidos para la amplificación isotérmica (LAMP). Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), México, 2017.

Table 7. Sequences and characteristics of oligonucleotides for Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primers. Nacional Center of Phytosanitary Reference (CNRF), Mexico, 2017.

PCR- Digital de gotas (ddPCR)

La técnica PCR-Digital de gotas (ddPCR, por sus siglas en ingles Droplet Digital PCR) se basa en la cuantificación absoluta de moléculas de ADN con una alta sensibilidad. Esta técnica permite procesar hasta dos millones de reacciones de PCR en una misma prueba, debido a que cada muestra se divide en aproximadamente 20 000 microgotas, las cuales son detectadas con sondas TaqMan (Hindson et al., 2011; Gutiérrez-Aguirre et al., 2015).

La ddPCR ha sido utilizada en diversos estudios como el análisis de mutaciones, estudios de genes y funciones específicas dentro de genomas, cuantificaciones absolutas, silenciamiento génico, entre otros (Pinheiro et al., 2012).

En el caso de los fitoplasmas, la sensibilidad de la técnica ha permitido el monitoreo de los efectores que segregan estos fitopatogénos al momento de modificar la permeabilidad de las células para invadirlas. En el trabajo publicado por Tan et al. (2016), se muestran las rutas metabólicas que siguen los efectores y el comportamiento de estos en la planta, empleando líneas transgénicas de Nicotiana benthamiana para expresar el efector secretado SAP11 de “Candidatus Phytoplasma mali” [16SrX]. Se observó que en presencia de dicho efector, la planta presenta un fenotipo de aroma alterado, además de demostrar que SAP11 desestabiliza algunos factores de transcripción y el ácido jasmónico que genera Nicotiana benthamiana como respuesta a la infección del fitoplasma. Este hallazgo proporciona información valiosa para comprender cómo los efectores producidos por los fitoplasmas influyen en la planta. Por otra parte, Mehle et al. (2014) reportaron la cuantificación absoluta, mediante ddPCR, del fitoplasma que produce la enfermedad conocida como “Flavescence dorée” [16SrV].

La técnica ddPCR permite el uso de los oligonucleótidos y sonda diseñados para la qPCR. Sin embargo, se debe tomar en cuenta que los equipos empleados en ddPCR no tienen el sistema óptico para realizar las lecturas en todas las longitudes de onda, por lo que, se recomienda marcar la sonda con un fluoróforo adecuado para el equipo a utilizar.

Otras técnicas de detección

Existen otras técnicas que pueden ser empleadas para la detección de fitoplasmas, entre ellas, los Ensayos de Movilidad Heterodúplex (HMA, por sus siglas en inglés de Heteroduplex Mobility Assay). Esta técnica ha permitido detectar las infecciones mixtas de fitoplasmas, así como la identificación y diferenciación genética de grupos estrechamente relacionados detectados en insectos vectores (Palmano y Firrao, 2000). Por otra parte, se han llevado a cabo ensayos mediante la técnica de Polimorfismo de la Longitud del Fragmento de Restricción Terminal (T-RFLP, por sus siglas en inglés de Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism), la cual consiste en la digestión enzimática con endonucleasas de restricción a partir de productos de PCR marcados con un fluoróforo para regiones terminales del 16SrRNA. Esta técnica ha sido empleada para la identificación de fitoplasmas e inclusión en grupos filogenéticos (Hodgetts et al., 2007).

Otra técnica que ha sido utilizada para la identificación de fitoplasmas es la denominada Polimorfismo Conformacional de una Sola Cadena (SSCP, por sus siglas en inglés de Single Strand Conformation Polymorphism). En esta, los amplicones obtenidos por PCR convencional son sometidos a un proceso de desnaturalización con el fin de producir cadenas de ADN sencillas, que son separadas de acuerdo con su estructura primaria, mediante electroforesis y, finalmente, visualizadas en un gel de poliacrilamida (Nejat y Vadamalai, 2013). Esta técnica ha sido empleada para detectar mutaciones y conocer la variabilidad molecular de distintos fitoplasmas, mediante el uso de los genes 16SrRNA, tuf, dnaB y hflB (Musič et al., 2008).

Conclusiones

La implementación de distintas técnicas moleculares basadas en la PCR ha permitido la detección, identificación y clasificación de los fitoplasmas, con el uso de oligonucleotidos diseñados a partir de distintas regiones y genes. Además, aún cuando no ha sido posible su aislamiento in vitro, se presentan las características generales de los genomas secuenciados de algunos fitoplasmas, por lo que, actualmente se tiene mayor conocimiento de su tamaño y composición.

El uso de la NGS y su posterior análisis bioinformático ha detallado el contexto genómico, donde es observable la pérdida de funciones metabólicas y de replicación celular autónoma; lo anterior sugiere una evolución reductiva como consecuencia de su vida como parásito intracelular en un medio rico en nutrientes. La información obtenida de los genomas publicados amplía el panorama para una mejor comprensión de los mecanismos implicados en su patogenicidad, lo que podría permitir en un futuro su cultivo axénico.

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