Uno de los grandes retos a los que se enfrentan las unidades de salud a nivel mundial, tiene que ver con el tratamiento y control de infecciones nosocomiales producidas por bacterias con resistencia o multiresistencia antibiótica. Este creciente problema de salud pública, tiene gran importancia en la actualidad, por las implicaciones económicas, sociales y humanas que causa. Además, genera una complicación importante en el cuidado hospitalario del paciente, que aumenta el índice de morbilidad y mortalidad, el tiempo de hospitalización y los costos asociados, el personal sanitario y el desgaste de los sistemas de salud (Barahona et al., 2014; Álvarez et al., 2014; Khan, Ahmad, & Mehboob, 2015). Ante esta situación, es conveniente fomentar la búsqueda de nuevos medicamentos a partir de fuentes naturales, ya que las perspectivas futuras en el uso de las drogas antibióticas de hoy son todavía inciertas. Por ello, la identificación y evaluación de moléculas con actividad biológica, aisladas de fuentes naturales, es cada vez más relevante en los estudios modernos a nivel mundial (Negi, 2012). La búsqueda de nuevos compuestos con actividad antibacteriana, dentro de la medicina herbolaria tradicional, representa un factor determinante para el tratamiento de las infecciones producidas por microorganismos. Sin embargo, es necesario categorizar este tipo de estudios, porque la actividad antimicrobiana de extractos vegetales puede diferir entre cepas de una misma especie. Adicionalmente, sus propiedades pueden variar en función de los órganos vegetales empleados, los métodos de extracción y pueden cambiar en función de las estaciones o periodos de recolecta y las diferentes condiciones fisicoquímicas del terreno (Martínez, Betancourt, Alonso, & Jauregui, 1996; Jain, Bansal, & Bhasin, 2009).

En general, las plantas y sus constituyentes ocupan una posición importante en el conocimiento de nuevas sustancias y principios activos (Gurib, 2006). En el mundo, se han desarrollado numerosas investigaciones enfocadas a la búsqueda de nuevos compuestos con propiedades antimicrobianas (Saha & Paul, 2014; Baharudin, Hamid, & Susanti, 2015). Curcuma longa L. (Zingiberaceae) se ha utilizado desde la antigüedad como condimento, colorante y estimulante aromático (Chairman, Jayamala, Christy, & Singh, 2015), y se le han atribuido propiedades antifúngicas (Al-Daihan et al., 2013), antibacterianas (Rawat & Rawat, 2015), antiparasitarias (Singh, Mehta, Mehta, & Shukla, 2011), antivirales (Kim et al., 2009), antioxidantes, antiinflamatorias (Ramadan, Al-Kahtani, & El-Sayed, 2011) y anticancerígenas (Annapurna, Suhasin, Raju, Jaya, & Siva, 2011). Si bien C. longa ha sido ampliamente estudiada por sus propiedades antibacterianas (Rao & Mittal, 2014; Gaikwad, Bodhankar, Ittadwar, & Waikar, 2014; Chairman et al., 2015), ha sido pobremente caracterizada en el contexto regional (Falco, Martínez, Rodríguez, Núñez, & Sevillano, 2011; García, Olaya, Sierra, & Padilla 2011; Coy & Acosta 2013), y en especial, frente a bacterias intrahospitalarias. Por ello, en la presente investigación se evaluó la actividad antibacteriana in vitro del extracto etanólico y del aceite esencial de C. longa, frente a bacterias nosocomiales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal: Los rizomas de C. longa fueron donados por la Secretaría Técnica de Plantas Medicinales, Aromáticas, Condimentarias y Afines, de sus cultivos ubicados en el municipio de Canalete (8°47’24’’ N - 76°14’28’’ W, altitud 50 msnm, 28 °C), Departamento de Córdoba, Colombia, en febrero 2013 durante la estación seca. La confirmación taxonómica fue realizada en el Herbario de la Universidad de Córdoba, donde reposa una muestra (HUC-003112).

Obtención del extracto crudo: Los rizomas se lavaron con agua destilada estéril; seguidamente, fueron cortados en rodajas de 2-4 mm de espesor y se secaron durante ocho horas a temperatura ambiente. Posteriormente, fueron pulverizados 300 g y sometidos a percolación por 48 horas con 1.5 L de etanol al 96 %. El disolvente se concentró al vacío a 45 °C en un rotaevaporador (BÜCHI Rotavapor R-200) hasta obtener el extracto crudo. A este extracto se le realizó una marcha fitoquímica preliminar, que es una prueba para determinar de manera cualitativa la presencia o ausencia de alcaloides, flavonoides, taninos, esteroides, antraquinonas y saponinas, siguiendo la metodología descrita en Sanabria (1983).

Obtención del aceite esencial: A partir de 500 g de rizoma, previamente cortados en rodajas y secados al sol durante dos horas, se obtuvieron 2.8 mL de aceite esencial, mediante destilación por arrastre con vapor de agua en un equipo tipo Clevenger. El aceite obtenido se secó con Na2SO4 anhidro y se almacenó a 4 °C protegido de la luz.

Microorganismos usados: Se emplearon cepas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus sp., Salmonella sp. y Bacillus sp., aisladas a partir de infecciones nosocomiales en el Hospital San Jerónimo de Montería y cepas de referencia S. aureus ATCC 43300, S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922 y K. pneumoniae ATCC 700603. Los cultivos bacterianos se crioconservaron a una temperatura de -20 °C en medio BHI (infusión cerebro corazón) que contenía 30 % (v/v) de glicerol y 0.6 % de agar. Las cepas de trabajo fueron mantenidas por subcultivos periódicos preservados a 4 °C. Para todo el estudio se siguió la normatividad ética establecida por el Ministerio de Salud de Colombia, en su resolución N°008430 de 1993.

Preparación y estandarización del inóculo bacteriano: Partiendo de un cultivo axénico, se tomaron de 3 a 5 colonias y se sembraron en 9 mL de caldo BHI (Merck), e incubadas a 36 ± 1 °C durante 16-18 horas. Tras la incubación, se realizaron diluciones seriadas de la suspensión bacteriana, midiendo la densidad óptica de cada dilución a 630 nm en un espectrofotómetro (GENESYSTM 20, Thermo Spectronic), hasta alcanzar una absorbancia comprendida entre 0.08 y 0.13 (Valgas, Souza, Smânia, & Smânia, 2007). Esta absorbancia correspondió a 2x108 UFC/mL, y a una turbidez 0.5 en la escala de MacFarland (CLSI, 2009; Alves, Guzman, Figueroa, Tello, & De Olivera 2011).

Actividad antibacteriana: Para los ensayos de actividad antibacteriana, el extracto etanólico y el aceite esencial, se diluyeron en dimetilsulfóxido DMSO al 10 % y Tween-80 al 5 %, respectivamente, a una concentración inicial de 2 000 ppm (Matasyoh, Kiplimo, Karubiu, & Hailstorks, 2007; Valgas et al., 2007). Las concentraciones a ensayar (100, 500 y 1 000 ppm), se obtuvieron por adición de caldo BHI (Valgas et al., 2007). La actividad antibacteriana se evaluó por el método de microdilución, siguiendo la metodología implementada por Valgas et al. (2007), y teniendo en cuenta las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI sobre la preparación y estandarización del inóculo bacteriano, que se ajustó como se describió previamente. Luego, 100 µL de las diferentes concentraciones del extracto etanólico y el aceite esencial, fueron distribuidas en una microplaca de 96 pozos. Cada pozo de prueba fue inoculado con 10 µL de la suspensión bacteriana. Como control de esterilidad se utilizaron pozos que contenían el extracto, pero que no fueron inoculados con el microorganismo, y como control de crecimiento, se utilizaron pozos con BHI sin el extracto, pero inoculados con el microorganismo. Los controles positivos fueron antibióticos comerciales (vancomicina, ciprofloxacina y cloranfenicol), mientras que los negativos fueron DMSO al 10 % y Tween-80 al 5 %. La bandeja de microdilución se incubó a 36 ± 1 °C por 24 horas. Tras la incubación, el crecimiento bacteriano se detectó por medición de la densidad óptica a 630 nm en un lector de ELISA (ChroMate® 4300). Para evaluar la viabilidad celular, se adicionaron 20 µL de una solución alcohólica (0.5 mg/mL) de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolium (MTT). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.

Se utilizó un diseño experimental completo aleatorizado, en el que se utilizaron tres réplicas para cada uno de los tratamientos anteriormente mencionados (concentraciones del extracto y controles). Con las absorbancias obtenidas se construyeron tablas en el programa Microsoft Excel®, expresando los resultados como medias ± desviaciones estándar. El efecto de las concentraciones de los extractos sobre el crecimiento de los microorganismos se determinó con el porcentaje de reducción del crecimiento bacteriano propuesto por (Sandasi, Leonard, & Viljoen, 2010) y ajustado por los autores, de la siguiente forma:

% RC = [(CC - CE) – (ATC - CE)]*100/(CC - CE)

Dónde: % RC es el porcentaje de reducción del crecimiento bacteriano; CC es la absorbancia obtenida para el control de crecimiento; CE es la absorbancia obtenida para el control de esterilidad; y ATC es la absorbancia obtenida para una determinada concentración del extracto, CC-CE expresa el crecimiento real de la bacteria, y ATC-CE el crecimiento real de la bacteria a una determinada concentración del extracto.

RESULTADOS

Los resultados de la actividad antibacteriana del extracto etanólico y del aceite esencial de los rizomas de C. longa se resumen en el cuadro 1. De forma general, se observa que a medida que aumenta la concentración del extracto etanólico y del aceite esencial, se produce una disminución en las absorbancias, reflejando una reducción en el crecimiento bacteriano (medido este como porcentaje de reducción de crecimiento, como fue descrito previamente). A todas las concentraciones evaluadas, el extracto etanólico mostró porcentajes de reducción de más del 50 % frente al crecimiento de la cepa K. pneumoniae ATCC 700603 [Kp ATCC 700603], y un aislado clínico de E. coli [Ec (AI)], siendo esta reducción evidente, a medida que aumentaba la concentración del extracto. Este comportamiento fue observado también contra las cepas S. aureus ATCC 25923 [Sa ATCC 25923], P. aeruginosa ATCC 27853 [Pa ATCC 27853] y aislados clínicos de P. aeruginosa [Pa (AI)] y K. pneumoniae [Kp (AI)] (Fig. 1), pero con porcentajes de reducción inferiores al 50 %.

La actividad antibacterial del aceite esencial fue menor que el observado con el extracto etanólico, y solo a concentración de 1 000 ppm mostró un porcentaje de reducción del crecimiento, superior al 50 % contra un aislado clínico del género Bacillus [B (AI)]. A esta concentración se obtuvieron los mayores porcentajes de reducción contra el resto de los microorganismos usados, destacando porcentajes de 43, 43, 39 y 33 % frente a S. aureus ATCC 25923 [Sa ATCC 25923], K. pneumoniae [Kp (AI) y Kp (AII)] y S. aureus ATCC 43300 [Sa ATCC 43300], respectivamente. Con el resto de bacterias se obtuvieron porcentajes inferiores (Fig. 2).

Los ensayos colorimétricos basados en la adición de MTT, reflejaron el crecimiento bacteriano, tras el viraje de color experimentado en cada uno de los pozos de la microplaca, excepto en el control de esterilidad. Se evidenció igualmente la inactividad de los controles negativos frente al crecimiento bacteriano. Es de resaltar que las absorbancias obtenidas en los pozos de prueba se mantuvieron por encima del control de esterilidad y por debajo del control de crecimiento, según lo esperado.

El análisis fitoquímico cualitativo preliminar del extracto etanólico, reveló la presencia de saponinas, taninos, alcaloides y flavonoides.

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en este estudio indican que el extracto etanólico y el aceite esencial de los rizomas de C. longa poseen propiedades antibacterianas. El extracto etanólico fue el de mayor potencial contra las bacterias evaluadas, con significativos porcentajes de reducción del crecimiento bacteriano. Hay reportes en la literatura científica que muestra valores de concentración mínima inhibitoria (MIC) y concentración mínima bactericida (MBC) de extractos de cúrcuma contra diferentes cepas bacterianas, que varían en el rango de 5 a 55 mg/mL (Chakraborty, Nath, Saikia, & Sengupta, 2014); estas son concentraciones superiores a las empleadas en este estudio. Asimismo, otros estudios han demostrado que los extractos hidroetanólicos obtenidos de los rizomas, tienen actividad antifúngica y antibacteriana frente a S. aureus ATCC 6538 y E. coli ATCC 25922 (Falco et al., 2011). Por otra parte, el extracto etanólico de las hojas y fracciones de diferente polaridad (hexano, acetato de etilo, butanol y etanol) presentaron actividad antimicrobiana contra S. aureus, E. coli y Aspergillus niger, mientras que los curcuminoides (curcumina, demetoxicurcumina y bisdemetoxicurcumina) tuvieron actividad frente a S. aureus y S. epidermidis (García et al., 2011). En otro estudio (Coy & Acosta, 2013) con el aceite esencial de C. longa, se obtuvo los siguientes porcentajes de inhibición de crecimiento de 70, 60, 10 y 10 %, respectivamente, frente a S. aureus ATCC 6538, E. faecalis ATCC 29212, E. coli ATCC 25922 y Salmonella tiphymurium ATCC 14028s, respectivamente. Investigaciones similares resaltan diversas propiedades biológicas en otras especies de cúrcuma, incluyendo la actividad antibacteriana y antifúngica de C. xanthorrhiza (Mary et al., 2012), C. cedoaria y C. malabarica (Wilson et al., 2005).

Los resultados obtenidos en este estudio, evidencian el perfil antibacteriano de extractos obtenidos de C. longa. Las propiedades antibacterianas del extracto etanólico y el aceite esencial de esta especie, pueden explicarse por el efecto sinérgico entre los diferentes componentes químicos de los extractos y/o por la presencia de otros componentes que incluso pueden ser activos a bajas concentraciones (Soković, Glamočlija, Marin, Brkić, & van Griensven, 2010). Los metabolitos activos de las plantas pueden exhibir su efecto antimicrobiano, por la degradación de la pared celular, disrupción de la membrana citoplasmática, salida de componentes celulares, alteraciones en la síntesis de ADN y ARN, en el transporte de electrones y en la absorción de nutrientes, afectando la producción de energía y modificando constituyentes en ácidos grasos y fosfolípidos (Shan, Cai, Brooks, & Corke, 2007). Un estudio reciente, revela que S. aureus muestra deformidad morfológica, con pérdida parcial de la membrana citoplasmática, al ser tratado con extractos obtenidos de los rizomas de C. longa (Gupta, Mahajan, & Sharma, 2015).

El perfil fitoquímico del extracto etanólico evaluado es consistente con los reportes bibliográficos, destacando la presencia de saponinas, taninos, alcaloides y flavonoides (Chairman et al., 2015), siendo estos últimos responsables de la actividad antibacteriana en varias plantas (Cordell, Quinn, & Farnsworth, 2001). Los resultados de este trabajo permiten concluir que la C. longa que crece en la región de Canalete, Córdoba, es capaz de producir compuestos con potencial antibacteriano frente a patógenos nosocomiales, lo que amerita continuar con la búsqueda de los componentes responsables de esta actividad, que puedan emplearse como alternativa terapéutica para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado en el marco del proyecto FCB-11-08, financiado por la División de Investigación de la Universidad de Córdoba. Los autores agradecen a Catalina Tovar, del Grupo de Investigación en Enfermedades Tropicales y Resistencia Bacteriana de la Universidad del Sinú, por la donación de las cepas ATCC.

RESUMEN

La resistencia bacteriana es un problema de salud creciente a nivel mundial que genera graves impactos económicos y sociales, comprometiendo la acción terapéutica de los antibióticos actuales. Por ello, la búsqueda de nuevos compuestos con propiedades antimicrobianas se hace más relevante en los estudios modernos, en especial frente a bacterias de interés clínico. En el presente estudio se evaluó la actividad antibacteriana in vitro del extracto etanólico y el aceite esencial de Curcuma longa L (Zingiberaceae), contra bacterias nosocomiales utilizando el método de microdilución. Se utilizaron cepas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus sp., Salmonella sp. y Bacillus sp., aisladas de infecciones nosocomiales en un centro hospitalario de la ciudad de Montería y cepas de referencia de S. aureus ATCC 43300, S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922 y K. pneumoniae ATCC 700603. El perfil antibacterial del extracto etanólico fue más evidente a las concentraciones más altas (1 000 ppm), obteniendo porcentajes de reducción significativos de más del 50 % frente a K. pneumoniae ATCC 700603 y un aislado clínico de E. coli, mientras que, frente al aislado clínico del género Bacillus fue más activo el aceite esencial. Para el resto de los microorganismos los porcentajes de reducción obtenidos a una concentración de 1 000 ppm variaron entre 17 y 42 % con el extracto etanólico y entre 8 y 43 % con el aceite esencial. A concentraciones de 100 y 500 ppm la actividad antibacteriana de los extractos fue menor. Los resultados obtenidos indican que el extracto etanólico y el aceite esencial de los rizomas de C. longa poseen compuestos activos con propiedades antibacterianas que podrían emplearse en investigaciones futuras, como una alternativa terapéutica para el tratamiento de infecciones producidas por patógenos nosocomiales.

Palabras clave: Curcuma longa, actividad antibacterial, Zingiberaceae, aceite esencial, microdilución.

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