El desarrollo agrícola ha conducido al incremento del uso de agroquímicos para el control de plagas en zonas de cultivos. Los efectos adversos observados para estas sustancias se atribuyen a su capacidad para atravesar las membranas biológicas e interactuar directamente o a través de sus metabolitos con blancos celulares (proteínas, lípidos y material genético) (Al Sabti, 1985; Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Goksøyr, 1991) produciendo cambios fisiológicos y con efectos adversos sobre el crecimiento, la reproducción, la longevidad y la sobrevivencia de los organismos (Anderson & Wild, 1994; Shugart & Theodorakis, 1998).

Aunque la evaluación de los efectos de contaminantes sobre la calidad de aguas de río son evaluados a través la detección y cuantificación de estos agentes mediante procedimientos de química analítica, hoy en día se recomienda incluir indicadores que permitan evaluar los efectos adversos sobre el ADN de la biota expuesta (Akpoilih, 2012; Osman, 2014). Los peces son excelentes bioindicadores ya que son muy sensibles a la presencia de contaminantes en el ambiente, y por esto son ampliamente utilizados en estudios de monitoreo ambiental como indicadores que permiten estimar los posibles efectos biológicos causados por una gran variedad de compuestos presentes en los ambientes acuáticos (Çavaş & Ergene-Gozukara, 2005; De Flora, Bagnasco, & Zanacchi, 1991; De Flora et al., 1993, Goksøyr, 1991; Lakra & Nagpure, 2009, Obiakor, Okonkwo, Nnabude, & Ezeonyejiaku, 2012; Udroiu, 2006).

La determinación de la frecuencia de eritrocitos micronucleados (EMN) es uno de los biomarcadores de efecto más empleados para evaluar los efectos genotóxicos y mutagénicos de los contaminantes presentes en el ambiente debido a que es un método sensible, rápido y se puede emplear fácilmente en condiciones de campo y de laboratorio (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Ali, Nagpure, Kimar, Kumar, & Kushwaha, 2008; Çavaş & Ergene-Gözükara, 2005; Jha, 2004). Los micronúcleos (MN) se forman durante la división celular como resultado de ruptura cromosómica (clastogenicidad) y/o disfunción del huso mitótico (aneugenicidad) (Al-Sabti & Metcalfe, 1995), por lo que su detección da cuenta de posibles efectos a causa de daño en el ADN. Este biomarcador ha sido ampliamente utilizado en peces porque permite la detección temprana de problemas ambientales en los ecosistemas acuáticos (Al-Sabti & Metcalfe, 1995, Ergene et al., 2007; Grisolia & Starling, 2001; Lopez-Barea, 1996; Polard et al., 2011b; Talapatra et al., 2007).

La cuenca media del Rio Grande se encuentra ubicada en Turbo, municipio localizado en la subregión de Urabá en el departamento de Antioquia (Colombia). Es un importante recurso para la población aledaña porque provee de zonas de pesca, agua de consumo y una fuente de riego para muchos cultivos en la región (Mintrabajo, 2013; Zamora & García-Valencia, 2007).

Para el 2012 la zona agrícola en Turbo ocupaba una extensión aproximada de 28 610 ha (Mintrabajo, 2013). Esta actividad se desarrolla en forma intensiva principalmente debido al cultivo de banano y plátano que constituyen el primer producto agrícola de la región (Mintrabajo, 2013; Zamora & García-Valencia, 2007). Estos monocultivos demandan la aplicación aérea de agroquímicos, especialmente del herbicida glifosato y del insecticida clorpirifos, cuya presencia ha sido detectada en las fuentes hídricas de esta región (CORPOURABA, 2007; INVEMAR, 2004; Vivas-Aguas et al., 2011; Bonilla, Peinado, Urdaneta, & Carrascal 2000) y sus efectos genotóxicos han sido reportados en una gran variedad de organismos (Çavaş & Könen, 2007; Cavas, 2011; Giesy, Dobson, & Solomon, 2000; Gollapudi, Mendrala, & Linscombe, 1995; Murthy, Kiran, & Venkateshwarlu, 2013; Nwani et al., 2010, 2011; Rahman, Mahboob, Danadevi, Banu, & Grover, 2002; Ruiz & Marzin, 1997; Ullah & Zorriehzahra, 2015). Adicionalmente, la contaminación de aguas superficiales con estas sustancias se da como resultado de procesos de escurrimientos pluviales y lixiviación (Polard et al., 2011a), los cuales se ven favorecidos en esta zona por una continua precipitación.

Brycon henni (Eigenmann, 1913), de la subfamilia Bryconinae, comúnmente conocida como sabaleta, es una especie dulceacuícola endémica de Colombia, que habita agua dulce, que se encuentra ampliamente distribuido en la región occidental de Colombia (Montoya-López, Carrillo, & Olivera-Ángel, 2006a). B. henni es una especie omnívora de alta adaptabilidad alimenticia, esquiva, gregaria y no migradora, y presenta dimorfismo sexual (Montoya-López et al., 2006a). Esta especie es importante como fuente de alimento para los pobladores ribereños de los cuerpos de agua que habita, además de ser el principal recurso pesquero tradicional en algunas zonas del país. Además, es una especie que ha demostrado sensibilidad ante la presencia de sustancias genotóxicas en el ambiente (Hurtado-Alarcón, Solarte-David, López-Ortiz, & Montoya-Herrera, 2007).

El objetivo de esta investigación fue comparar la frecuencia de EMN en sangre periférica de ejemplares de peces sabaleta (Brycon henni, Characiformes: Characidae) procedentes de dos estaciones de muestreo del Río Grande en Turbo (Golfo de Urabá, Antioquia) localizados río arriba y río abajo de una zona de cultivos con descargas directas de agroquímicos durante dos épocas climáticas contrastantes.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio: La cuenca del Río Grande comprende un área de 150 km2 y una longitud aproximada de 27 Km (Fig. 1). Nace en el alto Quimarí (670 msnm), Serranía de Abibe y vierte sus aguas al Río León (15 msnm), su caudal medio multianual es de 3.90 m3/s. Está ubicado en el extremo suroriental del municipio de Turbo y al noroccidente del departamento de Antioquia (Colombia). En la zona, se presenta una época de lluvia de abril a noviembre, y una época seca de enero a marzo; la precipitación promedio anual fluctúa entre 2 900 a 4 100 mm, la temperatura ambiente varía entre 26 a 28 ºC, la humedad relativa registra valores promedios mensuales entre el 83 y 86 %, y predominan los vientos alisios del norte.

Estaciones de muestreo: La estación 1 se ubica en las coordenadas 7°56.45’4” N - 76°36.14’00” W, en una zona en la que predominan bosques primarios y secundarios, ha sido poco alterada por actividades antrópicas, y no se presentan plantaciones de banano en el área. La estación 2, localizada en las coordenadas 7°56.23’4” N - 76°36.42’2.0” W, se encuentra en un área afectada por las descargas directas de agroquímicos procedentes de los cultivos de banano y plátano (Fig. 1).

Trabajo de campo: En cada estación se hicieron campañas de muestreo a lo largo de una época de lluvias (mayo a octubre) 2010 y una época seca (enero a marzo) 2011. En cada estación de muestreo se colectaron 18 ejemplares de B. henni durante la época de lluvias y 18 ejemplares en la época seca, para un total de 36 individuos por estación. En cada estación se tomaron medidas de los siguientes parámetros fisicoquímicos en el agua: temperatura (ºC), pH, oxígeno disuelto (OD) (mg/L), dióxido de carbono libre (CO2) (mg/L), porcentaje de saturación de oxígeno y alcalinidad (mg/L) (Cuadro 1).

La especie B. henni presenta una forma ovalada con coloración verdosa en el dorso y plateada en los costados, presenta una mancha en el opérculo y en la aleta caudal, además manchas rojizas en las aletas y mancha roja en la parte superior del ojo, es de tamaño pequeño a mediano, algunas veces crece hasta los 30 cm de longitud. B. henni es una especie que no aparece en ninguna de las categorías de riesgo propuestas por el libro rojo de peces dulceacuícolas de Colombia (Mojica, Castellanos, Usma, & Álvarez, 2002) ni tampoco en la lista de especies amenazadas por la UICN del 2003, además por uno de los principales recursos pesqueros en algunas zonas se presenta como alternativa de seguridad alimentaria para las poblaciones rivereñas de los ríos en los que habita. El trabajo de campo fue realizado con apoyo de los pescadores de la zona, por lo que todos los organismos analizados fueron especímenes capturados con atarraya en sesiones de pesca rutinaria. Por las anteriores razones no se necesitaron permisos especiales para su captura.

Se seleccionaron para el estudio aquellos individuos que superaron los 10 cm de longitud, tamaño que indica que el pez es adulto (Montoya-López, Tabares, Echeverri, Arboleda, & Olivera-Ángel, 2006b). A cada individuo le fue determinado el peso y longitud total (desde el extremo de la boca hasta el extremo de la aleta caudal con un ictiómetro convencional). El factor de condición por individuo se estimó mediante el índice de Fulton (K) (Ricker, 1975); K=100 (W/L 3), donde W es el peso corporal húmedo en gramos y L la longitud en cm.

Los peces fueron sacrificados con una sobredosis de Eugenol (Rubio & Silveira, 2009) e inmediatamente se obtuvo sangre periférica heparinizada (0.5 mL) de la vena caudal de cada individuo siguiendo la metodología propuesta por Nepomuceno y Spanó (1992) y Nepomuceno, Ferrari, Spanó y Centeno (1997). A partir de cada muestra se realizaron dos extendidos de sangre por individuo en portaobjetos limpios, los cuales se dejaron secar al aire durante 24 horas antes de ser procesados en el laboratorio. Los organismos fueron depositados en un recipiente conteniendo formalina al 10 % y transportados al laboratorio de Hidrobiología de la Universidad de Antioquia, Seccional Urabá, donde fue confirmada taxonómicamente la especie usando la clave descrita por Dahl (1971).

Trabajo de laboratorio: En el laboratorio los frotis de sangre se fijaron con un mezcla de Metanol: Ácido Acético (3:1) durante siete minutos, se dejaron secar a temperatura ambiente y se tiñeron con Giemsa al 5 % en tampón Sorensön pH 6.7 durante 20 minutos. Finalmente, las placas se lavaron con agua destilada y se dejaron secar a temperatura ambiente hasta su lectura y análisis.

Test de Micronúcleos: En cada lámina se contaron 1 000 eritrocitos con el objetivo de 100x en un microscopio óptico (marca Olympus, modelo CH30) para un total de 2 000 células por ejemplar. Para la identificación de los MN se siguieron los criterios propuestos por Fenech (2000) que indican que el tamaño debe ser entre 1/6 a 1/3 del diámetro del núcleo principal, deben estar claramente separados de la membrana nuclear y presentar igual coloración al núcleo principal. La frecuencia de EMN se determinó a partir de la siguiente expresión: Frecuencia de EMN = (No. de células con micronúcleo x 1 000)/No. total de células contadas.

Los datos se presentan como media±D.E. Para determinar su comportamiento paramétrico o no paramétrico se usaron las pruebas de Kolmogorov Smirnov y Shapiro Wilk. Mediante la prueba de Wilcoxon se analizó la homogeneidad de los muestreos por estación de muestreo. Las diferencias entre las estaciones y la incidencia de la época climática se determinaron mediante la prueba de Mann-Whitney. La relación entre los parámetros biométricos (longitud, peso y factor de condición) y la frecuencia de EMN fue determinada por medio de una correlación de Spearman. En todos los casos, las diferencias fueron consideras estadísticamente significativas si P < 0.05.

RESULTADOS

Todos los parámetros fisicoquímicos variaron las épocas climáticas, siendo mayor la temperatura, el pH y la alcalinidad del agua durante la época seca en las dos estaciones, mientras que los valores de oxígeno disuelto, dióxido de carbono y porcentaje de saturación del oxígeno fueron mayores durante la época de lluvias. No hubo diferencias entre los parámetros fisicoquímicos al comparar las estaciones de muestreo independientemente de la época climática (Cuadro 1).

Incidencia de factores biométricos en la frecuencia de EMN: Se encontró una relación significativa entre longitud-peso (Spearman, rs = 0.91, P = 0.0000), longitud-factor de condición (Spearman, rs = 0.32, P = 0.0064) y factor de condición-peso (Spearman, rs = 0.45, P = 0.0002). Sin embargo, ninguno de estos parámetros biométricos presentó una relación significativa con la frecuencia de EMN.

Incidencia de las estaciones de muestreo en la frecuencia de EMN: Se encontró diferencia significativa (Mann-Whitney, P = 0.018) en la frecuencia de EMN asociada a la procedencia de los ejemplares de B. henni. La frecuencia media de EMN en sangre periférica de los ejemplares capturados en el área de influencia directa de la actividad agroindustrial (estación 2) fue 0.15 (Desviación Estándar, DE = 0.18, número de ejemplares, N = 36). Este valor duplicó la frecuencia de EMN de los peces procedentes de la zona poco alterada (estación 1) cuya media fue 0.06 (DE = 0.08, N = 36) (Cuadro 2, Fig. 2).

Incidencia de la época climática en la frecuencia de EMN: En todas las estaciones se encontró la mayor frecuencia de EMN durante la época seca. Para la estación 1, la frecuencia media de EMN durante la época seca fue 0.07 (DE = 0.09, N = 18) mientras que durante la época de lluvias la media fue 0.05 (DE = 0.06, N = 18). Para la estación 2, la frecuencia media de EMN durante la época seca fue 0.21 (DE = 0.19, N = 18) y presentó diferencia significativa (Mann-Whitney, P = 0.001) respecto a la media encontrada en la época de lluvias (0.04 ± 0.07, N = 18) (Cuadro 2, Fig. 2).

DISCUSIÓN

Los peces pueden actuar como organismos centinelas para indicar el efecto potencial ante la exposición a agentes genotóxicos de origen químico presentes en el agua, y la aplicación de la prueba de MN en peces es ampliamente utilizada en estos organismos como biomarcador, que permite la detección temprana de problemas ambientales en los ecosistemas acuáticos (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Çavaş & Ergene-Gözükara, 2005; Lopez-Barea, 1996; Murthy et al., 2013; Nwani et al., 2010, 2011; Udroiu, 2006). Los peces de la especie Carassius auratus han demostrado un incremento en la frecuencia de EMN como respuesta a la exposición a pesticidas y herbicidas ampliamente usados en agricultura (Cavas, 2011; Çavaş & Könen, 2007). En la especie Carassius carassius se describió incremento en la cantidad de quiebres en el ADN de especímenes capturados en aguas afectadas por actividades agrícolas en comparación con ejemplares procedentes de una zona sin ese tipo de descargas (Polard et al., 2011a).

Hurtado-Alarcón et al. (2007) reportaron a B. henni como una especie con potencial como bioindicadora de la calidad del ambiente al mostrar sensibilidad ante la presencia de agentes genotóxicos en el agua mediante el uso del test de MN (Hurtado-Alarcón et al., 2007). Los resultados del presente estudio confirman dicho potencial al reportar un valor considerablemente superior en la frecuencia de EMN de los ejemplares de B. henni procedentes de una zona del Río Grande con influencia directa de la zona bananera que experimenta descargas de agroquímicos con potencial genotóxico y mutagénico.

La frecuencia de EMN significativamente mayor en la sangre de individuos capturados en la época seca, podría indicar aumento de las concentraciones de los xenobióticos como resultado de la reducción de los caudales y de la velocidad del flujo de agua. Durante la aplicación de los plaguicidas, las lluvias de corta duración durante la época seca facilitan el transporte de residuos a las aguas superficiales (Ferenczi, Ambrus, Wauchope, & Sumner 2002, Polard et al. 2011b, Schulz, 2001). En las corrientes de agua dulce con alta contaminación, está descrito el incremento diez veces superior en la concentración de algunos herbicidas y fertilizantes y en la frecuencia de EMN en peces luego de su aplicación en la época seca (Taghavi et al., 2010, Polard et al., 2011a).

En la zona de estudio se usan permanentemente agroquímicos como fertilizantes y herbicidas relacionados con la agricultura de plátano y banano, principal actividad económica de la región. Esos compuestos ingresan inicialmente a las plantaciones y, debido a que los canales de riego están en contacto directo con los ríos, terminan finalmente llegando a los causes principales como el Río Grande en Turbo - Antioquia. Entre los principales mecanismos de acción asociados a la exposición a agroquímicos se encuentran daños en genes, proteínas, alteraciones enzimáticas, cambios en la replicación del ADN y alteraciones que llevan a mutaciones (Çavaş & Könen, 2007; Murthy et al., 2013; Ullah & Zorriehzahra, 2015). Estos últimos mecanismos están implicados en los efectos clastogénicos observados en eritrocitos de peces, como B. henni, expuestos a estos agentes.

Los resultados de este estudio confirman la importancia de la cuantificación de la frecuencia de EMN en sangre periférica de peces como un marcador biológico eficiente de la presencia de contaminantes genotóxicos en el ambiente, para programas de monitoreo y control de la calidad del agua en áreas afectas por el desarrollo de actividades económicas que pueden afectar la calidad del aguas. Además, se confirma la sensibilidad de la sabaleta (B. henni) ante la presencia de genotóxicos en el ambiente y su uso como organismo centinela en estudios de monitoreo ambiental como indicadora de la calidad del agua.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la financiación de esta investigación al Fondo para el Desarrollo de la Investigación en las Regiones de la Dirección de Regionalización y la Vicerrectoría de Investigación a través del Comité para el Desarrollo de la Investigación -CODI- 2009.

RESUMEN

La producción agrícola de monocultivo permanente de banano y plátano en la parte media del Río Grande (Turbo - Antioquia) requiere de la aplicación de diferentes plaguicidas. Prácticas inapropiadas en la producción y cultivos de plátano realizadas en esta región a menudo conllevan a contaminación con agroquímicos que llegan a este cuerpo de agua por procesos de lixiviación y escorrentía. Los peces son los vertebrados más utilizados como especies bioindicadoras de la calidad del agua porque son muy sensibles a la presencia de contaminantes en el ambiente. El objetivo de esta investigación fue comparar la frecuencia de eritrocitos micronucleados (EMN) en sangre periférica de ejemplares de peces sabaleta (Brycon henni) procedentes de dos estaciones del Río Grande que difieren en su grado de contaminación por agroquímicos. Se evaluó la frecuencia de EMN en sangre periférica de peces B. henni procedentes de cada estación durante dos épocas de lluvia de 2010 y dos época secas de 2011. Las muestras de sangre fueron obtenidas de la vena caudal, fijadas durante 24 horas y luego teñidas con Giemsa. La frecuencia de EMN fue significativamente mayor en el área impactada por agroquímicos. La frecuencia media de EMN fue mayor en la estación con impacto directo de agroquímicos (0.15±0.18) que en la estación poco alterada (0.06±0.08). Además, la frecuencia de EMN en B. henni fue significativamente mayor en la época seca. Los resultados de este estudio indican que el análisis de las EMN en B. henni puede ser recomendada como un método adecuado para la detección in situ de agentes genotóxicos en el ambiente.

Palabras clave: frecuencia de eritrocitos micronucleados, biomarcadores, agroquímicos, Brycon henni, daño en el ADN.

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