En México, la región sur comprende los estados de Tabasco, Campeche, Chiapas, Yucatán y Quintana Roo, así como parte de Guerrero, Oaxaca y Veracruz, reconocidos productores de petróleo. En marzo 2016, la región tuvo una producción de 376 Mbd (miles de barriles diarios de producción de hidrocarburos líquidos) y 1 331 MMpcd (millones de pies cúbicos diarios) (PEMEX, 2016). Sin embargo, aunado a esta producción el detrimento ambiental es considerable, pues sólo del 2000 al 2014 se han generado 846 emergencias ambientales, de las cuales el 10.3 % se registraron en el estado de Tabasco (PROFEPA, 2014). La mayoría de los sitios contaminados con petróleo y sus derivados, se encuentran en humedales o sitios anegados, que limitan el uso de especies fitorremediadoras bajo estas condiciones ambientales (García-López, Zavala-Cruz & Palma-López, 2006; Hernández-Rivera et al., 2011). El petróleo según el tiempo que permanece en el ambiente puede ser fresco (PF) o intemperizado (PI), por lo que su efecto tóxico, cancerígeno, mutagénico y genotóxico puede variar (Caravaca & Roldán 2003; Rainho, Corrêa, Mazzei, Aiub, & Felzenszwalb, 2013). Los hidrocarburos del PF pueden volatilizarse, disolverse en la solución del suelo, ser absorbidos en la superficie del suelo o ser transformados en otros compuestos por diferentes procesos químicos y bioquímicos (Peña, Trasar, Gil, & Leirós, 2007; Wang, Zhan, Zhou, & Lin, 2010). Con la modificación de las propiedades químicas del suelo y los cambios en los ciclos bioquímicos, esto origina la mortalidad de la flora y fauna, (OMI, 2005; Hernández-Castellanos et al., 2013). Por otro lado, el PI es aquel que permanece en la intemperie más de 10 años (Capó, 2007; Zavala-Cruz, Trujillo-Capistrán, Ortiz-Ceballos, & Ortiz, 2013), y tiene efectos tóxicos más graves que el PF, por los hidrocarburos recalcitrantes, los cuales presentan mayor tiempo y grado de degradación, al estabilizarse en el medio ambiente (Fernández et al., 2006; Maletic, Dalmacija, Roncevic, Agbaba, & Garcina, 2011).

La fitorremediación es una tecnología que utiliza plantas para degradar, extraer, acumular y estabilizar contaminantes orgánicos e inorgánicos del suelo (Lum, Ngwa, Chikoye, & Suh, 2014). El sistema radical de las gramíneas puede alcanzar profundidades de hasta 2.7 m, así como una alta tolerancia a condiciones climáticas extremas, altas concentraciones de salinidad o acidez, y presencia de metales pesados (Paz-Alberto & Sigua, 2013; Mganga, 2014; Chávez-Rodríguez, 2015), lo que permite la estimulación y el establecimiento de poblaciones de microflora tanto en rizoplano como rizósfera, que contribuyen a la degradación de moléculas orgánicas (Uren, 2001; Bisht et al., 2015). L. hexandra Swartz (Oryzeae, Poaceae) es una especie endémica del estado de Tabasco, es una opción interesante para la evaluar su desempeño en la descontaminación de suelos, debido a su crecimiento en humedales, por su sistema de raíz rizomatoso y largos estolones fibrosos, que le permiten sobrevivir en periodos de sequía, lluvias y nortes (tormentas con fuertes vientos) (Aparicio et al., 2007; Liu, Duan, Zhang, Zhu, & Xiaoyan, 2011; Shao-Hong, Xue-Hong, Jie, Yi-Nian, & Chen, 2013). El objetivo de este estudio, fue determinar la capacidad fitorremediadora de L. hexandra a partir de la densidad de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre de la rizósfera, la producción de biomasa seca (MS), y la descontaminación de los hidrocarburos (DS) del suelo con petróleo fresco (PF) e intemperizado (PI) en condiciones de anegamiento.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el bioensayo, se recolectó (abril 2012, época de sequía) suelo de la zona, caracterizado como tipo Gleysol (GL) de dos sitios, a partir del horizonte superficial (0-30 cm). El primer sitio y primera muestra de suelo, no presentó contaminación antrópica derivada de la industria petrolera, y se localiza en el ejido Arroyo Hondo Santa Teresa, Cárdenas, Tabasco, México (17º59’53” N - 93º25’01” W) (GL1). El segundo sitio, presentó un derrame crónico de petróleo que, a pesar de haber sido restaurado, han persistido concentraciones de hidrocarburos del petróleo. Sin embargo, por el tiempo de exposición a los factores ambientales, se consideró un suelo contaminado con altos contenidos de hidrocarburos de PI; este sitio se localiza en el ejido José Narciso Rovirosa, a dos kilómetros al suroeste del complejo procesador de gas La Venta, Huimanguillo, Tabasco (18º4’37” N - 94º2’28” W). De este sitio se recolectaron cinco muestras de suelos (GL2, GL3, GL4, GL5 y GL6), a los que se le determinó y registró conforme NOM-021-RECNAT-2000 (DOF, 2002) (Cuadro 1), norma mexicana que establece las especificaciones de fertilidad, salinidad y clasificación de suelos. Estudios, muestreo y análisis.

Los ejemplares de L. hexandra Swartz (Oryzeae, Poaceae) se recolectaron del sitio contaminado. Se preparó tres almácigos en contenedores de plástico con suelo GL1 y se colocó en un túnel de plástico (16 m largo, 6 m ancho y 2.5 m de alto) en las instalaciones del Colegio de Postgraduados, Campus-Tabasco. De los tallos maduros, se cortaron estolones de cinco centímetros de longitud con raíces, y se sembraron 60 días antes de establecer los experimentos, para el traslado a las unidades experimentales. La altura de las plántulas establecidas en el experimento fue en promedio de 12 ± 3.7 cm de altura (30 días después de sembrarlos en los almácigos).

Diseños experimentales: El bioensayo constó de dos experimentos (E1 y E2) con arreglo bifactorial (dosis de HTP y tiempo de evaluación) y se estableció en agosto del 2012, en base a los requerimientos del Protocolo 208 de la Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico (OECD, 2003) modificado (Rivera-Cruz & Trujillo-Narcia, 2004), que permite identificar los síntomas de estrés que genera una sustancia química, en la emergencia y crecimiento de plántulas y plantas. Con ocho tratamientos en el E1 y cinco tratamientos en el E2, con ocho repeticiones por tratamiento, ambos completamente al azar. Para obtener concentraciones de 6 000, 10 000, 30 000, 60 000, 90 000, 120 000, 150 000 y 180 000 mg.kg-1 b. s. HTPF del E1. Los tratamientos del E2 con 14 173, 28 400, 50 598, 75 492 y 112 142 mg.kg-1 b. s. HTPI correspondieron a los suelos GL2, GL3, GL4, GL5 y GL6, respectivamente. Para ambos experimentos, el suelo G1 (2 607 mg.kg-1 b. s. HTP) se consideró como tratamiento testigo. Cada unidad experimental (U. E.) contenía 1.5 kg de suelo (Fig. 1).

En el E1, el suelo de cada unidad experimental del GL1 se molió y tamizó previo a ser mezclado con las cantidades 12, 15, 45, 90, 108, 144, 210 y 252 g PF, y se homogenizó con una varilla de vidrio, la mezcla se colocó en contenedores de vidrio (15x14.5 cm). En el caso de los suelos del E2 (GL2, GL3, GL4, GL5 y GL6) se molieron, tamizaron y homogenizaron antes de ser depositados en los contenedores, posteriormente las unidades experimentales se colocaron en el túnel de plástico de manera aleatoria (Fig. 1). En ambos experimentos, a cada unidad experimental se trasplantó una planta de L. hexandra y se aplicó riego con una probeta de plástico de 1 000 mL cada 24 h para mantener condiciones de anegamiento del suelo (ocho centímetros arriba del suelo). A los tres y seis meses, aleatoriamente se destruyeron cuatro unidades experimentales por tratamiento de cada experimento, se recolectó suelo con rizósfera para evaluar las poblaciones de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre totales (BFN), la producción de MS y DSC del suelo de L. hexandra.

Densidad de bacterias fijadoras de nitrógeno: Se evaluó con el método de dilución seriada y determinación de cuenta viable en cajas de Petri (Madigan, Martinko, Dunlap & Clark, 2009). Se utilizó los medios de cultivos: carbón combinado para las BFN (Rennie, 1981), rojo congo para el grupo de AZP (Reinhold et al., 1987), y el medio Ashby para el grupo AZT (Dӧbereiner, Marriel & Nery, 1966).

Porcentaje de descontaminación: El porcentaje se determinó con la concentración de HTP, que se basó en la cuantificación por la NMX-AA-134-SCFI-2006 (DOF, 2006).

Producción de materia seca: Para determinar la producción de MS (biomasa seca foliar y radical), las plantas se secaron en horno a 70 ºC durante 48 h y se pesaron en balanza analítica (Atrya, modelo TE4101).

Se utilizó el software SPSS para determinar el análisis de varianza y la prueba de medias entre los tratamientos (Tukey p ≤ 0.05).

RESULTADOS

Densidad de bacterias fijadoras de nitrógeno: A los tres y seis meses, las poblaciones de BFN presentaron una estimulación en la rizósfera de L. hexandra con diferencias significativas entre los tratamientos (Tukey p ≤ 0.05) (Cuadro 2). En el PF el tratamiento con 120 000 mg.kg-1 b. s. HTPF presentó la mayor densidad de BFN, a los tres y seis meses con 90x102 y 26x103 UFC.g-1 rizósfera seca (r.s.), respectivamente. Sin embargo, las densidades de AZP y AZT entre tratamientos y tiempo de evaluación fueron irregulares. En PI las BFN y AZT alcanzaron la mayor densidad en suelo con 112 142 mg.kg-1 b. s. HTPI con valores de 41 x 102 y 22 x 102 UFC.g-1 r.s., respectivamente. Por el contrario, a los seis meses disminuyó la densidad de BFN y AZT, al incrementar los contenidos de HTPI de los suelos, a excepción del suelo con 14 173 mg.kg-1 b. s. HTPI (22 x 102 y 16 x 102 UFC.g-1 r.s., respectivamente), las densidades de AZP fueron inhibidas en ambos tiempos con el PI.

Producción de la materia seca: L. hexandra presentó diferencias significativas tanto en los tipos de petróleo como en los tiempos de evaluación en relación al suelo testigo (Tukey, p ≤ 0.05). La mayor producción de MS (28.4 y 65.2 g) se registró en los tratamientos con las concentraciones de 90 000 y 150 000 mg.kg-1 b. s. HTPF, es decir un aumento con respecto al suelo testigo de 4.92 y 17.17 % (Fig. 2). Así mismo, los tratamientos con PI, registraron la mayor producción de MS (47.4 y 88.4 g) en los tratamientos con 28 400 y 112 142 mg.kg-1 b. s. HTPI, un aumento del 43.03 y 38.91 % en relación al testigo.

Degradación de petróleo fresco e intemperizado: En la figura 3, se observó a los tres y seis meses diferencias estadísticas en los porcentajes de descontaminación de los suelos contaminados con PF y PI con respecto al testigo (Tukey p ≤ 0.05). A los tres meses, la mayor DSC de suelos se registró en dosis de 150 000 mg.kg-1 de PF y en 14 173 mg.kg-1 b. s. de PI, con 67 y 77 %, respectivamente. A los seis meses, la mayor DSC de PF y PI se observó en 6 000 y 14 173 mg.kg-1 b. s., respectivamente, con 87 % y 86 %, pero en PF los suelos con 6 000, 10 000, 30 000, 60 000 y 90 000 mg.kg-1 b. s. fueron estadísticamente iguales en el porcentaje de DSC.

DISCUSIÓN

La investigación reveló un comportamiento variable, tanto en la densidad de BFN como por el tipo de petróleo, aunque es claro que los contenidos de PI estimularon la presencia BFN a concentraciones menores de 50 598 mg.kg-1 b. s. HTPI a los seis meses. Esta respuesta probablemente se asocia a que los hidrocarburos del petróleo permiten la disponibilidad de carbono orgánico total y nitrógeno inorgánico en el suelo, los cuales son utilizados como fuente de energía en los procesos metabólicos de las bacterias, lo que permite su adaptación (Caravaca & Roldán, 2003; Pérez-Vargas, Anaya-Reza, Chang-Solís, Membrillo-Venegas, & Calva-Calva, 2010). Acuña, Pucci y Pucci (2012) explican que la deficiencia de nitrógeno en suelos produce la disminución de la biomasa microbiana, la mineralización y eliminación de hidrocarburos; esta deficiencia favorece a la degradación de hidrocarburos aromáticos por BFN; por el contrario, la presencia de nitrógeno en el suelo, puede enfocar la degradación de hidrocarburos alifáticos. Sin embargo, sólo un número limitado de especies bacterianas tiene la capacidad combinada de la fijación de nitrógeno y la oxidación de hidrocarburos (Trujillo-Narcía et al., 2014). La reducción de las bacterias en la rizósfera de L. hexandra en suelos con PF y PI, puede ser causado por la represión de la síntesis de proteína y DNA de los microorganismos, al estar expuesto a hidrocarburos policíclicos aromáticos como el naftaleno, fluoreno y pireno (Sun, Wang, Sun, Peng, & Deng, 2012; Penton et al., 2013). Además, el pH es un factor clave para el crecimiento de bacterias nitrificantes, ya que su óptimo crecimiento se encuentra en un pH neutral o ligeramente alcalino. Por lo tanto, al disminuir el pH de un suelo a causa de la contaminación por petróleo, se induce a la reducción del número de bacterias nitrificantes (John, Itah, Essien, & Ikpe, 2011; Zamora, Ramos, & Arias, 2012).

La producción de materia de L. hexandra por encima de los 50 kg, nos indica la capacidad de crecimiento y adaptación a sitios contaminados con hidrocarburos. Una respuesta similar registró Zand, Bidhendi y Mehrdadi (2010) en Zea mays y Festuca arundinacea en suelos con 34 358 y 26 994 mg.kg-1 b. s. HTP. Vaziri, Panahpour y Mirzaee-Beni (2013) explican que una producción de materia vegetal continua, puede ser efectiva, no solo por la prospección de las raíces, sino por los exudados radicales que mejoran la actividad catabólica de los microorganismos de la rizósfera. Así mismo, las condiciones de anegamiento permiten el aumento de la materia vegetal por el transporte de material fotosintético a las raíces, esto favorece el crecimiento y desarrollo del tejido fotosintético (Liu, Jadeja, Zhou, & Liu, 2012; Ciotti, Castelán, Hack, Porta, & González, 2014). El crecimiento y desarrollo vegetal de L. hexandra estimuló la actividad metabólica de los microorganimos, que pudo generar el proceso de óxido-reducción de los hidrocarburos del PF y PI en la rizósfera (Khan, Afzal, Iqbal, & Khan, 2013). El proceso de óxido-reducción se basa en el uso de hidrocarburos como sustrato (donador de electrones) en la respiración de las células microbianas cuyo fin es la producción de biomasa (energía), de modo que la actividad metabólica de la célula acaba degradando y consumiendo dicha sustancia; dependiendo del tipo de aceptores del proceso, este puede denominarse anaerobio (O2) o anaerobio (NO3-, SO42-, Fe3+, Mn4+ y CO2) (Zambrano & Araujo, 2015).

Estos resultados indican que la rizosfera de L. hexandra durante los seis meses, estimuló positivamente la producción de materia seca, el establecimiento de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre, de los grupos Azospirillum y Azotobacter, en dosis altas de petróleo y en condiciones de anegamiento. Además, los porcentajes de descontaminación superiores al 80 %, demuestran el potencial fitorremediador de L. hexandra para suelos contaminados con petróleo fresco e intemperizado.

AGRADECIMIENTOS

Agradecimiento al Colegio de Postgraduados por fideicomiso revocable de administración e inversión No 167304 para el establecimiento y operación de los fondos para la investigación científica y desarrollo tecnológico del centro público. Al CONACYT-México por la beca otorgada al M.C. Alfredo Arias Trinidad para realizar su posgrado en el Programa de Producción Agroalimentario en el Trópico del Colegio de Postgraduados, Campus-Tabasco.

RESUMEN

La industria petrolera ha generado derrames crónicos de petróleo y su acumulación en Gleysoles en zonas anegadas en el estado de Tabasco, en el sureste de México. El anegamiento es un factor que limita el uso de tecnologías de remediación por el alto costo y los bajos niveles de degradación del petróleo, sin embargo, Leersia hexandra Sw. es un pasto que crece en estas zonas contaminadas con petróleo intemperizado. El objetivo del estudio fue evaluar la densidad de bacterias, producción de biomasa vegetal y fitorremediación de L. hexandra en suelo contaminado con petróleos fresco e intemperizado, bajo condiciones experimentales de anegamiento. Se realizaron dos experimentos (E1 y E2) en un túnel de plástico. El E1 se basó en ocho dosis: 6 000, 10 000, 30 000, 60 000, 90 000, 120 000, 150 000 y 180 000 mg kg-1 base seca (b. s.) de hidrocarburos totales de petróleo fresco (HTPF), y en el E2 se evaluaron cinco dosis: 14 173, 28 400, 50 598, 75 492 y 112 142 mg kg-1 b. s. de hidrocarburos totales de petróleo intemperizado (HTPI), con ocho repeticiones en cada experimento, además se utilizó un testigo con 2 607 mg kg-1 b. s. de HTP de origen biogénico. Las variables evaluadas a los tres y seis meses fueron 1) densidad microbiana de las bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre totales (BFN), del grupo Azospirillum (AZP) y Azotobacter (AZT), por cuenta viable en placa seriada; 2) producción de materia seca total (MS), se cuantificó por el peso seco por gravimetría, y 3) el porcentaje de descontaminación de los hidrocarburos (DSC) por extracción en equipo soxhlet. En suelos con HTPF, la población de BFN, AZP y AZT se estimuló hasta cinco veces más que el tratamiento testigo a los tres y seis meses; sin embargo, concentraciones de 150 000 y 180 000 mg kg-1 b. s. inhibieron entre un 70 y 89 % la densidad bacteriana. A su vez, en suelos con PI, la inhibición se registró hasta en un 90 %, a excepción del tratamiento con 14 173 mg kg-1 b. s., el cual estimuló las BNF y AZT en 2 y 0.10 veces más que testigo, respectivamente. La producción de MS fue continua en los experimentos hasta los seis meses, con valores de 63 y 89 g en PF y PI, respectivamente; sin diferencias significativas con el testigo (p ≤ 0.05). El DSC alcanzó valores del 66 % al 87 % en HTPF como HTPI a los seis meses, respectivamente. Estos resultados demuestran la habilidad del L. hexandra para desarrollar una rizósfera con alta densidad de BFN, producir biomasa vegetal y fitorremediar Gleysoles con petróleo fresco e intemperizado en ambientes tropicales inundados.

Palabras clave: Azotobacter, Azospirillum, pasto tropical, petróleo intemperizado, fitorremediación.

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CUADRO 1

Propiedades físicas y químicas de los suelos recolectados de los sitios de estudio

TABLE 1

Physical and chemical properties of soil collected from the study sites

Suelo	Textura	pH	Materia orgánica (%)	Nitrógeno total (%)	Hidrocarburos totales del petróleo (mg.kg-1 b. s.)
GL11	Arcillosa	6.9	10.18	0.4	2 607
GL22	Arcillosa	6.09	21.93	0.6	14 173
GL3	Arcillosa	5.71	23.00	0.5	28 400
GL4	Arcillosa	5.36	16.39	0.6	50 598
GL5	Arcillosa	6.49	23.59	0.5	75 492
GL6	Arcillosa	6.14	16.39	0.5	112 142

1. Suelo testigo (hidrocarburos de origen biogénico) generado por quema de vegetación.

2. Suelos del sitio dos (GL2-GL6) presentan concentraciones de petróleo que superan los límites máximos permisibles estipulados en la NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2008 (DOF, 2013).

CUADRO 2

Densidad de bacterias fijadoras de nitrógeno y grupos (Azospirillum y Azotobacter) de la rizósfera

de Leersia hexandra de suelos contaminados con petróleo fresco e intemperizado, a los tres y seis meses

TABLE 2

Total nitrogen-fixing bacteria and groups (Azospirillum y Azotobacter) density in rhizosphere

of Leersia hexandra in soil with fresh and weathered oil

HTP (mg.kg-1 b. s.)	Tres meses (10-1 UFC.g-1 b. s.)			Seis meses (10-1 UFC.g-1 b. s.)
	BFN	AZP	AZT	BFN	AZP	AZT
Fresco
Testigo	150b	21b	199g	463de	171b	1 422a
6 000	185b	23b	541d	182e	44e	85d
10 000	155b	21b	765c	494d	258a	122cd
30 000	172b	25ab	288f	395e	27f	283b
60 000	182b	23b	909a	1 394c	58de	257b
90 000	175b	22b	843b	1 594b	142bc	278b
120 000	262a	21b	297f	2 598a	109cd	227b
150 000	165b	32a	555d	41f	41e	235b
180 000	32c	31a	356e	137e	74de	247b
Intemperizado
Testigo	150c	21a	199b	463b	171a	1 422b
14 173	10e	14c	36e	827a	31c	1 633a
28 400	17e	16b	135d	333c	79bc	1 188b
50 598	77e	10c	171c	216d	125ab	629c
75 492	167d	11c	162c	120e	99b	1 153b
112 142	417a	12c	220a	120e	116b	1 190b

*Valores con diferentes letras por columna del mismo color son estadísticamente diferentes (Tukey, p≤0.05).

*Values with different letters per column of the same color are statistically different (Tukey, p≤0.05).