01-RINCON-Alteraciones_causadas_por_Puccinia_nakanishikii_en_Cymbopogon

Las royas (Pucciniales, Basidiomycetes) son un grupo de hongos fitopatógenos biótrofos obligados de mayor diversidad, distribución e importancia económica (Savile, 1984; Staples, 2000; Agrios, 2005; Singh et al., 2008; Voegele, Hahn, & Mendgen, 2009). Están conformadas por 13 familias, 163 géneros y unas 7 000 especies de distribución cosmopolita, excepto en los polos (Buriticá, 2001; Zuluaga, Buriticá, & Marín, 2009; Hawksworth & Lücking, 2017). Las royas macrocíclicas poseen la capacidad de generar cinco tipos de esporas funcionalmente diferentes en su ciclo de vida (espermacias, aeciosporas, teliosporas, urediosporas y basiodiosporas) y la posibilidad de parasitar uno o dos diferentes hospederos de grupos taxonómicos no relacionados para completar su ciclo de vida (Cummins & Hiratsuka, 2003, Agrios, 2005; Webster & Weber, 2007; Schumann & D’Arcy, 2009; Zuluaga et al., 2009). Así mismo, las royas son los hongos que presentan la mayor diversidad de hospederos, incluyendo musgos, licófitos, helechos, gimnospermas y angiospermas (Pardo, 2003).

Las enfermedades ocasionadas por las royas son de las más devastadoras que se pueden presentar en plantas, causando reducción del follaje, disminución del crecimiento radicular, reducción de la tasa fotosintética y aumento de la tasa respiratoria (Doohan & Zhou, 2018). Con lo cual, la producción por cosecha disminuye enormemente y lo poco que se puede aprovechar es de mala calidad nutricional; lo que afecta la producción de alimentos a nivel mundial (Epstein, Simons, Frey, & Rothman, 1998; Leyva, Espitia, Villaseñor, & Huerta, 2004; Agrios, 2005; Singh et al., 2008; Kolmer, Ordonez, & Groth, 2009; Singh et al., 2016; Bhattacharya, 2017; Carris & Littlefield, 2017; Doohan & Zhou, 2018).

Las royas afectan principalmente los cultivos de cereales, por ejemplo, la roya del trigo (Puccinia graminis Pers.), avena (Puccinia coronata Corda), centeno (Puccinia triticina Ericks.), sorgo (Puccinia purpurea Cooke.) y maíz (Puccinia sorghi Schwein.). Se estima que a nivel mundial anualmente se pierde 10 % de las cosechas debido a la infección de estos fitopatógenos (Pavgi, 1972; Eversmeyer & Kramer, 2000; Staples, 2000; Agrios, 2005; Singh et al., 2008; Zuluaga et al., 2009; Singh et al., 2016; Bhattacharya, 2017; Carris & Littlefield, 2017; Doohan & Zhou, 2018). Las enfermedades causadas por royas también han provocado grandes pérdidas en cultivos de algodón (Puccinia cacabata Arthur & Holway), café (Hemileia vastatrix Berk & Br.), pinos (Cronartium flaccidum Alb. & Schwein.), manzanos (Gymnosporangium juniperi-virginianae Schwein.) y plantas ornamentales (Pardo, 1998; Salazar, Buriticá, & Cadena, 2002; Agrios, 2005; Buriticá & Salazar, 2007).

Tradicionalmente, la clasificación taxonómica de Pucciniales se ha basa en las características morfológicas, el tamaño y la ornamentación de la pared de las teliosporas, uredosporas y basiodiosporas (Cummins, 1971; Cummins & Hiratsuka, 2003), y el tamaño y la forma del espermogonio (Hiratsuka & Hiratsuka, 1980; Cummins & Hiratsuka, 2003). Así mismo, se han hecho grandes esfuerzos para la determinación de las relaciones filogenéticas de las especies de royas utilizando diferentes marcadores moleculares (Maier, Begerow, Wei, & Oberwinkle, 2003; Zuluaga et al., 2009; Dixon, Castlebury, Aime, Glynn & Comstock, 2010; Zuluaga, Buriticá, & Marín, 2011).

Los estudios de las royas en Colombia se iniciaron entre 1801 y 1803 con las observaciones hechas por Francisco José de Caldas en las que concluyó el origen parasitario del polvillo del trigo (Salazar et al., 2002; Zuluaga et al., 2009), posteriormente Mayor (1913) describió 158 especies de Pucciniales pertenecientes a 13 géneros de las cuales 84 fueron consideradas nuevas especies. Chardón y Toro (1930) reconocieron 610 especies, de las cuales, 44 se describieron como especies nuevas. A partir de la década de los setenta, Buriticá (1978, 1991, 2001, 2003) Pardo (1998, 2003), Salazar y Buriticá (2003, 2004, 2008) y Salazar et al., (2002) centran su atención en trabajos taxonómicos, descriptivos y enfocados principalmente en plantas de importancia económica como las aromáticas, ornamentales y culinarias; logrando consolidar varios inventarios sobre la diversidad de Pucciniales en este país (Buriticá, 1978, 1991; Buriticá & Pardo, 1996; Buriticá & Salazar, 2007; García, Buriticá, & Henao, 2007). En años recientes, Buriticá, Salazar y Pardo (2014) en una extensa revisión de las royas de Colombia registran 70 géneros distribuidos en 456 especies.

Cymbopogon citratus (DC.) Stapf es conocida comúnmente como limoncillo, es una hierba perenne procedente del sureste asiático distribuida globalmente en zonas tropicales y subtropicales (Pareek & Gupta, 1985; Soto, Vega, & Tamajón, 2002; Negrelle & Gómez, 2007; Nelson, 2008; Scot, 2008). C. citratus pertenece a la familia Poaceae que incluye aproximadamente 11 000 especies de amplia distribución y de importancia económica y ecológica (GPWG, 2012). Es una planta utilizada para la obtención de aceites esenciales, producción de celulosa, sílica y algunos óxidos metálicos (Guerra, Rodríguez, García, & Rangel, 2004; Haque, Remadevi, & Naebe, 2018) En Colombia se cultiva principalmente en los departamentos de Antioquia y Caldas con el fin de obtener citronela, un aceite esencial de amplio uso comercial y por el extenso y fibroso sistema radicular que posee la planta es utilizada como protector del suelo contra la erosión en la zona cafetera colombiana (Serrato & Moreno, 2003). Varios factores afectan la producción de aceites esenciales a partir de esta planta, entre estos, uno de los más importantes es la infección producida por las royas del género Puccinia (Pers. ex Pers.). A nivel global dentro de las royas más importantes registradas por causar grandes daños en plantas de C. citratus se encuentran Puccinia nakanishikii Dietel., P. purpurea y Puccinia cymbopogonis Massee (Pardo, 1999; Vida, Carvalho, & Verzignassi, 2006; Nelson, 2008; Melo, Araújo, Carvalho, Tostes, & Arêas, 2010). En Colombia se indica la presencia de P. nakanishikii y P. cymbopogonis en C. citratus (Morales & Salazar, 2014).

Los principales síntomas causados por estos tipos de roya en C. citratus son daños en las hojas. Las lesiones se presentan como manchas alargadas y de coloración pardo-rojizo oscuro, tanto en la cara adaxial como abaxial de las hojas, alcanzando hasta 0.5 cm de largo y con masas de esporas (Vida et al., 2006; Morales & Salazar, 2014). A medida que avanza la infección, toda la planta puede llegar a tener este mismo color pardo, así como grandes manchas necróticas a lo largo de la superficie foliar, ocasionando la muerte de las plantas en etapas avanzadas de la infección, llevando a la devastación de los cultivos (Nelson, 2008).

Aunque se han hecho grandes avances en aspecto citológicos, bioquímicos y moleculares relacionados con la infección de las royas (Mendgen & Hahn, 2002; Carver & Gurr, 2006; Voegele et al., 2009; Voegele & Mendgen, 2011). Los trabajos sobre los aspectos histopatológicos de las infecciones ocasionadas por estos hongos son pocos y la mayoría aborda el tema de forma superficial y poco detallada (Srivastava & Abraham, 1977; Kloppers & Piietorius, 1995; Bender, Pretorius, Kloppers, & Spies, 2000; Hernandez & Hennen, 2003; Moldenhauer, Moerschbacher, & Westhuizen, 2006; García et al., 2007; Li, Windham, & Trigiano, 2007; Jiang & Kang, 2010; Wesp, Martinelli, Sganzerla, & Soares, 2013; Wahyuno & Kakishima, 2015).

Por estas razones, en esta investigación se realizó una descripción pormenorizada de los aspectos histopatológicos y anatómicos de las hojas de C. citratus infectas con la roya P. nakanishikii. Detallando los efectos causados por el crecimiento y desarrollo de las hifas sobre la epidermis y los tejidos que constituyen el mesófilo foliar. Así mismo, se describen a nivel estructural y ultraestructural los estados espóricos encontrados en las hojas del hospedante. Con lo cual se presentan datos nuevos y originales sobre aspectos histológicos del hospedante relacionados con la infección y el ciclo de vida de la roya P. nakanishikii.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras de las hojas de C. citratus fueron recolectadas desde abril hasta agosto 2013 en época de lluvias y época seca respectivamente, en la escarpa noroccidental de la meseta de Bucaramanga-Colombia a 910 m de altitud (7°08’47’’ N - 73°08’0384’’ W). Las muestras incluyeron tanto hojas sanas como enfermas, con lesiones ocasionadas por P. nakanishikii en diferentes momentos del desarrollo. Los ejemplares de respaldo se depositaron en el Museo Micológico de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín (MMUNM) con la clave 1 788. Las muestras sanas y enfermas de C. citratus se fijaron en una mezcla de formol, etanol y ácido acético (FAA) por 24-48 horas a 6 °C, se cortaron en fragmentos de 1 cm de longitud, se deshidrataron en la serie gradual de alcoholes y aclaramiento en Xilol (Ruzin, 1999) y se incluyeron en Paraplast plus (Mc Cormick®) durante 12 horas a 55 °C. Se obtuvieron secciones transversales con micrótomo rotatorio LEICA RM® 2125, entre 5-7 μm de grosor. Finalmente, se procedió a la tinción de las muestras con Safranina-azul de Alcian y azul de Alcian-Hematoxilina. Para descripciones adicionales, algunas muestras se fijaron en Glutaraldehído al 2.5 % en buffer fosfato, pH 7.2 y 0.2 M durante 24-48 horas a 6 °C. Luego de la fijación, las muestras se lavaron en el mismo buffer y con agua destilada para luego postfijarlas con tetróxido de osmio al 2 % por 4 horas a 6 °C en oscuridad y agitación constante. Posteriormente, se deshidrataron durante una hora en cada etapa de la serie de etanol y durante 12 horas en etanol al 100 % a 6 °C y se embebieron en mezclas progresivas de óxido de propileno-resina Spurr, por una semana a temperatura ambiente. Se hicieron varios cambios de resina pura durante seis días en constante agitación. La resina fue polimerizada a 60 °C por 48 horas. Se obtuvieron secciones de 0.4-0.5 μm con cuchillas de vidrio en ultramicrótomo Leica®, que se tiñeron con azul de toluidina (TBO) en bórax al 1 %, pH 3.6 por 30-60 segundos (Ruzin, 1999; Yeung, Stasolla, Sumner, & Huang, 2015).

Adicionalmente, se elaboraron secciones transversales de las hojas a mano alzada de material fresco sano y afectado por el patógeno, este material se observó sin teñir y con epifluorescencia, empleando filtro UV-2A con filtro de excitación de 330-380 nm y filtro barrera de 420 nm.

Para llevar a cabo las descripciones morfológicas con MEB, el material vegetal infectado con P. nakanishikii se fijó en Glutaraldehído y se deshidrató en 2.2 dimetoxipropano (Lin, Falk, & Stocking, 1977), posteriormente se efectuó el desecado a punto crítico con un desecador SAMDRI®-795. Los fragmentos de las hojas se montaron sobre cinta conductiva de carbón de doble cara y se recubrieron con oro en una ionizadora DENTON VACUUM DESK IV® durante 5 minutos, y se observaron con un JEOL JSM-6490LV®. En esta investigación las observaciones estructurales y microestructurales se enfocaron principalmente en la cara abaxial de la lámina foliar, mesófilo, haces vasculares y estados espóricos encontrados. Se procesaron las regiones mediales de las hojas maduras sanas y enfermas, en este último caso en las zonas donde se presenta la infección y las lesiones causadas por la roya.

Las secciones en resina y parafina se examinaron con un microscopio fotónico Nikon eclipse Ni equipado con sistema de contraste diferencial de interferencia (CDI). Las fotografías se obtuvieron con cámara digital Nikon DS-Fi1® utilizando el programa NIS Elements versión 4.30.02 de Nikon.

RESULTADOS

Hojas y tejidos sanos de C. citratus

C. citratus es una gramínea perenne, cespitosa, rizomatosa, de hojas acintadas, usualmente aromática (Fig. 1A). Las hojas de C. citratus presentan simetría dorsiventral con venación paralelodroma, las hojas son predominantemente hipostomáticas, es decir con estomas ubicados principalmente en la cara abaxial de la lámina foliar, formando filas paralelas entre sí (Fig. 1B). Los estomas son poco frecuentes en la cara adaxial de la lámina foliar. La epidermis abaxial está formada por una capa de células que forman largas filas paralelas en torno a las venas. Estas células pueden ser largas o cortas, y por lo general de contorno rectangular (Fig. 1B). Se observó la presencia de tricomas unicelulares espinosos, orientados formando filas paralelas. Estos tricomas se caracterizan por presentar una zona apical aguda y una base ensanchada (Fig. 1B). Los microtricomas bicelulares forman filas paralelas y estos se presentan distanciados unos de otros. Estos tricomas son cortos de una célula basal hinchada y una distal delgada. Las células de la epidermis abaxial se encuentran cubiertas por una capa de ceras epicuticilares que se disponen a manera de láminas o escamas cortas densamente empaquetadas y que cubren profusamente a los estomas (Fig. 1C).

El mesófilo de la lámina foliar no está claramente diferenciado entre parénquima de empalizada y parénquima esponjoso (Fig. 1D, Fig. 1E). Las células parenquimatosas cercanas a la cara abaxial de la lámina foliar son pequeñas y con abundantes cloroplastos; en tanto que las del lado adaxial son más grandes y con una vacuola que ocupa la mayor parte del volumen celular (Fig. 1D, Fig. 1E). La densa distribución de los cloroplastos en estos tejidos se evidenció por su autofluorescencia en la longitud de onda correspondiente al rojo, al observar las secciones a mano alzada y con luz UV (Fig. 1E). Tanto la epidermis adaxial como la abaxial presentan autofluorescencia en la longitud de onda de emisión del azul, al igual que el xilema y el esclerénquima. La mayoría de los tejidos parenquimátosos no fotosintéticos también presentan autofluorescencia y paredes ligeramente engrosadas que reaccionan con la Safranina produciendo un color rojo, indicando parcial lignificación (Fig. 1E). Se observaron haces vasculares colaterales cerrados de mayor y menor diámetro; los de mayor diámetro están recubiertos por una vaina esclerenquimática y soportados por columnas de este mismo tejido que se proyectan hasta la epidermis adaxial y abaxial adosándose a pequeñas células epidérmicas de contorno cuadrado o papilares de paredes engrosadas (Fig. 1D, Fig. 1E). En estos haces vasculares se observó grandes elementos metaxilemáticos asociados con protoxilema (Fig. 1E). Los haces vasculares de menor diámetro están rodeados por una vaina parenquimática monoestratificada radial que presenta cloroplastos en disposición centrifuga típico de la anatomía Kranz o C4 (Fig. 1F, Fig. 1G). Cada uno de estos haces vasculares esta soportado por una columna de esclerénquima que se une a la epidermis abaxial. Estos haces vasculares generalmente presentan solo protoxilema (Fig. 1F). Los estomas son superficiales y se comunican con los tejidos internos a través de una amplia cavidad subestomática que se forma en el tejido parenquimatoso subyacente (Fig. 1F, Fig. 1G). Las células de la epidermis adaxial forman agrupaciones irregulares de células buliformes, separadas por agrupaciones de células epidérmicas pequeñas de contorno cuadrado y de paredes engrosadas que se asocian al tejido esclerenquimático (Fig. 1D, Fig. 1F).

Hojas infectadas, estados espóricos
y aspectos histopatológicos

Los síntomas iniciales de la infección se manifiestan como manchas de color amarillento y progresan a un color marrón a medida que se desarrollan los urediosoros con masas de esporas. Posteriormente, con el avance del daño celular, las lesiones se tornan marrón oscuro o negras. Estas lesiones son alargadas y coinciden con el patrón de venación de las hojas y orientación de los estomas (Fig. 1H). Las lesiones son visibles tanto en la cara adaxial como en la cara abaxial de la lámina foliar. A medida que la enfermedad se desarrolla las lesiones tisulares se expanden por toda la hoja llevando a la muerte prematura de la misma y defoliación de la planta.

Las pústulas que se observan sobre la cara abaxial de la lámina foliar corresponden a urediosoros que se orientan de forma paralela en el mismo sentido de los estomas y demás células epidérmicas (Fig. 2A). En los urediosoros se observan masas de urediosporas ovadas u obovoides de pared equinulada, sostenidas por una célula pedicelar y con 4-5 poros germinativos en posición ecuatorial (Fig. 2B, Fig. 2D). Entre las masas de urediosporas se observan paráfisis capitadas rectas (Fig. 2E). Los teliosoros solo se observaron en estados avanzados de la infección, estos son hipófilos y de color marrón oscuro (Fig. 2F), con teliosporas elipsoides de pared lisa y pedicelo persistente de color marrón pálido (Fig. 2G). Las urediosporas son la fase reinfecctante de la roya, estas se unen principalmente a la cara abaxial de la lámina foliar formando un pad o almohadilla de adhesión que se evidencia por la degradación de las ceras epicuticulares en este punto (Fig. 2H). La urediospora germina y el tubo de germinación se desarrolla de forma perpendicular a las células epidérmicas (Fig. 3A). El tubo germinativo se puede ramificar y a medida que se desarrolla degrada las ceras epicuticulares a su paso (Fig. 3B). Finalmente, el tubo germinativo alcanza el estoma y penetra a través del ostiolo para alcanzar la cavidad subestomática y colonizar el mesófilo foliar (Fig. 3C). En los preparados observados no fue posible la observación de apresorios. Una vez dentro del mesófilo, las hifas parasitan primero a los tejidos fotosintéticos y se inicia la formación de un nuevo urediosoro (Fig. 3D). A medida que las urediosporas y las paráfisis capitadas crecen y desarrollan ejercen presión sobre la epidermis que se va levantando progresivamente hasta desprenderse (Fig. 3E, Fig. 3F). El desarrollo de las urediosporas inicia con la diferenciación de una hifa que forma la célula pedicelar y la célula inicial de la urediospora. Las urediosporas inmaduras presentan una pared delgada translucida que permite la observación de los dos núcleos característicos del estado dicarionte, pero a medida que la pared se engrosa y desarrolla, los núcleos se hacen menos conspicuos (Fig. 3F, Fig. 3H). El urediosoro, prosigue su desarrollo, con lo cual se forman nuevas urediosporas que son liberadas y terminan colonizando otras áreas en la hoja, formando nuevos urediosoros (Fig. 3H, Fig. 4A).

Los tejidos fotosintéticos inmediatamente debajo del urediosoro se ven fuertemente afectados, las células se van desorganizando y colapsando progresivamente hasta experimentar desorganización del citoplasma y perdida de la integridad de la pared celular y por último la muerte de tejidos (Fig. 4B). Para esta etapa de la infección los cloroplastos han colapsado y se evidencia el depósito progresivo de polifenoles en el citoplasma y paredes celulares primarias. Así mismo, las células buliformes y el resto de las epidérmicas de la cara adaxial también sufren estos procesos de deterioro celular hasta morir (Fig. 4C, Fig. 4D). En estados avanzados de la infección, la necrosis y muerte de los tejidos se hacen evidentes en los haces vasculares, afectando fuertemente al floema, en este se aprecia coagulación o precipitación del citoplasma. En tanto que en el xilema la pared lignificada se observa con insipientes ondulaciones (Fig. 4E, Fig. 4F, Fig. 5A). Rápidamente toda la hoja se va deteriorando y la necrosis y colapso celular avanza por la lámina foliar (Fig. 5B).

En las secciones de material fresco, y no teñidas, en las zonas no afectas por el crecimiento de la roya, los tejidos conservan su integridad celular y color verde por la presencia de los cloroplastos. Al observar estas mismas secciones con luz ultravioleta, se observó autofluorescencia roja en los tejidos fotosintéticos, debido a la presencia de clorofila en los cloroplastos. Por el contrario, las zonas afectadas por infección, se aprecian de color marrón oscuro debido a la necrosis celular causada por el patógeno (Fig. 5C). Las zonas necróticas no presentan autofluorescencia, lo que implica daño en los cloroplastos y degradación de la clorofila (Fig. 5D).

Asociados a los urediosoros maduros se observaron conidiomas tipo picnidios, probablemente del hongo hiperparásito, Sphaerellopsis Cooke (Fig. 5E). Los picnidios son negros, subglobosos y con un ostiolo apical en posición central, por donde se liberan masas de picnidiosporas (Fig. 5F). Estas estructuras de reproducción asexual son hialinas, de pared lisa, de contorno fusiforme-elipsoidal, de ápice subobtuso y se aprecian en grandes cantidades en los urediosoros (Fig. 5F, Fig. 5G). Los picnidios se ven estrechamente adheridos al mesófilo justo donde se encuentran las hifas del urediosoro que parasitan los tejidos fotosintéticos del hospedante (Fig. 5H).

DISCUSIÓN

En investigaciones previas se ha determinado que las hojas de C. citratus son principalmente hipostomáticas de simetría dorsiventral, con estomas de amplias cavidades subestomáticas formando filas paralelas a las venas, y tricomas espinosos unicelulares, así como, microtricomas bicelulares, y densas ceras epicuticulares principalmente sobre la superficie abaxial; en tanto que la superficie adaxial está formada principalmente por agrupaciones de células buliformes y células epidérmicas alargadas o cortas de contorno rectangular a cuadrado en sección trasversal y con escasos tricomas (Metcalfe, 1960; Bertea & Maffei, 2010; Eltahir & Abuereish, 2010; Shah, Kaur, Dhabiliya, & Shri, 2012; Kellogg, 2015). Estas características de las hojas descritas por estos autores son similares a lo observado en esta investigación para C. citratus, aunque con ligeras diferencias, como la presencia ocasional estomas sobre la superficie adaxial de la lámina foliar. No obstante, se debe tener en cuenta que pequeñas variaciones entre las descripciones de uno u otro autor se podrían relacionar con el lugar exacto de las hojas donde se realizaron las secciones, el número de muestras analizadas o incluso el estado de desarrollo de las hojas. Metcalfe, (1960), Bertea y Maffei (2010) y Kellogg (2015) indican la falta de diferenciación entre el parénquima de empalizada y el esponjoso de las hojas de C. citratus, así como las diferencias relacionadas con el mayor tamaño de las células parenquimatosas no fotosintéticas de la cara adaxial; estas observaciones son congruentes con los hallazgos registrados en esta investigación. Estas células parenquimatosas carecen de inclusiones citoplasmáticas, al parecer esta situación permitiría el paso de luz hacia las células parenquimatosas fotosintéticas presentes en la cara abaxial de la lámina foliar.

Las características anatómicas observadas en C. citratus en relación con el metabolismo C4 o Kranz característico de esta gramínea y la cual es consistente con la presencia de una banda uniestratificada radial de parénquima fotosintético con cloroplastos en posición centrifuga, principalmente alrededor de los haces vasculares de menor diámetro, es congruente con lo registrado en la literatura para esta especie y otras monocotiledóneas que tienen este mismo tipo de metabolismo (Metcalfe, 1960; Bertea et al., 2003; Bertea & Maffei, 2010; Eltahir & Abuereish, 2010; Shah, Kaur, Dhabiliya, & Shri, 2012; Lundgren, Osborne, & Christin, 2014; Kellogg, 2015).

Buckley, Sack y Gilbert (2011) determinaron que las hojas heterobáricas presentan una conexión hidráulica directa entre el tejido vascular y la epidermis, facilitando y permitiendo a los estomas una respuesta rápida a la disponibilidad del agua. Así mismo, dividiendo a las hojas en compartimentos funcionales que pueden afectar su estructura y función que bajo determinadas circunstancias favorecería un tipo determinado de anatomía. En este sentido, Torres, Silva, Nogueira, Alvarenga y Silva (2016) encontraron que las hojas heterobáricas son frecuentes en lugares de alta radiación solar y temperatura, por el contario las hojas homobáricas son más frecuentes en ambientes de baja radiación solar y alta humedad. Las hojas tipo heterobáricas, y con metabolismo C4 de C. citratus podrían favorecer el crecimiento de estas plantas en las duras condiciones tropicales donde normalmente se cultivan. No obstante, para darle apoyo a esta hipótesis, sería necesario realizar esta clase de investigaciones en monocotiledóneas sometidas a condiciones climáticas similares a la especie de estudio, dado que la mayoría de las investigaciones fisiológicas y anatómicas de hojas, hasta el momento están principalmente restringidas a dicotiledóneas (Kellogg, 2015).

Las lesiones por P. nakanishikii y la forma en que estas se desarrollan en las hojas de C. citratus, son similares a las registradas por esta misma especie de materiales procedente de varias regiones del mundo donde esta roya afecta de manera drástica los cultivos (Pardo, 1999; Ploetz, Palmateer, Lopez, & Aime, 2013; Nelson, 2008; Morales & Salazar, 2014). Sin embargo, las lesiones causadas por las tres especies de royas P. nakanishikii, P. purpurea y P. cymbopogonis que más afectan a los cultivos de esta planta aromática, son muy similares; por tal razón, para su identificación exacta se hace necesaria la revisión microscópica para detallar caracteres taxonómicos como son la posición de los poros germinativos de las urediosporas y la forma y presencia de paráfisis capitadas (Gardner, 1985; Koike & Molinar, 1999; Melo et al., 2010; Morales & Salazar, 2014). Las observaciones hechas en esta investigación corroboran la circunscripción del material fúngico con la especie P. nakanishikii.

En trabajos previos se ha evidenciado que los urediosoros formados por P. nakanishikii en las hojas de C. citratus son hipófilos y erupentes, formando líneas paralelas entre sí que coinciden con la disposición de las estomas que son los sitios por donde entra el tubo germinativo. Así mismo, las urediosporas se han descrito como ovadas, de pared equinulada, con 4-5 poros germinativos en posición ecuatorial; también indican la presencia de paráfisis capitadas rectas en el urediosoro (Melo et al., 2010; Ploetz et al., 2013; Morales & Salazar, 2014). Aunado a los caracteres antes mencionados, el desarrollo de teliosoros hipófilos, que solo se presentan en etapas avanzadas de la infección, con escasas teliosporas de pared lisa y pedicelo persistente, son características morfológicas similares a las observadas en esta investigación para P. nakanishikii en las hojas de C. citratus.

En Pucciniales se ha observado la formación de la almohadilla de adhesión, que se origina en la zona de contacto entre la pared de la urediospora y las ceras epicuticulares. Esta almohadilla se aprecia como una cicatriz que refleja el contorno de la urediospora por donde se adhiere a la epidermis. Se ha indicado que previo a la inducción de la formación de esta almohadilla, las interacciones de hidrofobicidad, así como la intervención de las espinas de la pared de la urediospora son fundamentales para esta adhesión inicial (Mendgen, 1996; Clement, Porter, Butt, & Beckett, 1994; Carver & Gurr, 2006; Voegele et al., 2009; Voegele & Mendgen, 2011; Serrano, Coluccia, Torres, L’Haridon, & Métraux, 2014). Posterior a la adhesión, la almohadilla inicia su formación por la actividad de enzimas como cutinasas y lipasas liberadas por las urediosporas y la matriz extracelular que las recubre (Mendgen, 1996; Clement, Butt, & Beckett, 1993a; Clement, Martin, Porter, Butt, & Beckett, 1993b; Clement, Porter, Butt, & Beckett, 1997; Carver & Gurr, 2006; Hardham, 2007; Voegele et al., 2009; Voegele & Mendgen, 2011; Serrano et al., 2014). En C. citratus se pudo apreciar la formación de la almohadilla de adhesión, y probablemente debido a las coincidencias en las observaciones es posible que el origen y desarrollo de esta estructura sea similar a la descrita por estos autores.

En royas se ha podido determinar que una vez que las urediosporas germinan, el tubo de germinación se desarrolla perpendicular a las células epidérmicas foliares, lo que indica la importancia de la microtopografía para determinar la dirección del crecimiento de esta estructura (Read, Kellock, Collins, & Gundlach, 1997; Clement, Porter, & Beckett, 1998; Hardham, 2007; Voegele et al., 2009; Watkinson, Boddy, & Money, 2016). Así mismo, algunos autores han indicado la degradación de las ceras epicuticulares por parte del tubo germinativo a medida que este crece y se ramifica generando mensajeros moleculares que están relacionados con el proceso de patogénesis y el bloqueo de la maquinaria de defensa de la planta (Read et al., 1997; Maheshwari, 2007; Hardham, 2007; Voegele et al., 2009; Voegele & Mendgen, 2011; Aoun, 2017). Los hallazgos de esta investigación en relación con el desarrollo del tubo germinativo y degradación de las ceras epicuticulares por P. nakanishikii parasitando hojas de C. citratus son similares a los descritos por estos autores. No obstante, estos mismos investigadores indican la formación de un apresorio a medida que el tubo germinativo se aproxima al estoma, estructura que no se observó en esta investigación. La ausencia de esta estructura es probable se pudo deber a que, en el material analizado y fotografiado, el apresorio aún no se desarrollaba.

En la mayoría de hongos biotróficos, entre estos las royas, se ha observado que una vez que las hifas han alcanzado la cámara subestomática invaden los tejidos subyacentes, principalmente los fotosintéticos. Posteriormente, los haustorios penetran en las células de las cuales obtienen sus nutrientes provocando que éstas se vayan deteriorando progresivamente (Soto, Förster, DeMasson, & Adaskaveg, 2005; Li et al., 2007; García et al., 2007). A medida que la infección progresa y se hace necesario una mayor cantidad de nutrientes para mantener a los urediosoros en crecimiento, la infección se expande hasta los tejidos fotosintéticos más internos, como la vaina que recubre los haces vasculares, en el caso de las gramíneas (Li et al., 2007; García et al., 2007). Estos eventos relacionados con la patogénesis en la mayoría de las royas son similares a los observados en las hojas de C. citratus infectadas con P. nakanishikii. Sin embargo, en esta investigación no se observó el desarrollo de los haustorios, pero sus efectos sobre los tejidos fueron evidentes, resaltando principalmente el colapso y la necrosis celular.

La acumulación de polifenoles en las paredes celulares primarias o en el citoplasma es un proceso que se ha documentado como respuesta de las plantas ante la infección causada por hongos, así como por otros factores bióticos, he incluso abióticos. Se ha indicado que los polifenoles pueden reforzar las paredes celulares primarias impidiendo la penetración de los haustorios a las células y también interfieren con la germinación de las esporas (Lattanzio, Lattanzio, & Cardinali, 2006; Aoun, Rioux, Simard, & Bernier, 2009; Aoun, 2017). Pero dados los procesos coevolutivos, los hongos fitopatógenos han desarrollado mecanismos para desarticular esta respuesta al ataque (Dai, Andary, Cosson, & Boubals, 1995; Aoun, 2017). En la patogénesis causada por P. nakanishikii en C. citratus uno de los procesos más destacados que se aprecia es la acumulación progresiva de polifenoles en tejidos, lo cual se evidenció por la extensa tinción roja en respuesta a la Safranina de las hojas atacadas, lo que termina con la muerte prematura de las hojas, lo cual es consistente con las observaciones de estos autores. La detección indirecta de polifenoles por la tinción con Safranina y otros colorantes, ha sido documentada anteriormente (O’brien & Mccully, 1981; Ruzin, 1999)

Además de la acumulación de polifenoles, otros aspectos histopatológicos relevantes observados en C. citratus en respuesta a la infección por P. nakanishikii, se relacionan principalmente con la desorganización y el colapso progresivo de los tejidos fotosintéticos hasta la muerte de los tejidos. Adicionalmente, con la evolución de la infección, los tejidos parenquimatosos no fotosintéticos y los epidérmicos adaxiales, terminan por afectarse. Estos aspectos histopatológicos son similares a los descritos en la literatura para este tipo de organismos fitopatógenos biotróficos (Longo et al., 1997; García et al., 2007; Li et al., 2007). Así mismo, se ha documentado que en etapas avanzadas de la infección por hongos biotróficos, el floema también se ve afectado (Soto et al., 2005; Omara & Adbelaal, 2018). Con lo cual concordamos, ya que el floema de C. citratus en infecciones avanzadas con P. nakanishikii se aprecia colapsado. Sin embargo, Omara & Adbelaal (2018) no aprecian ningún efecto de la roya del trigo sobre el xilema, lo cual contrasta con esta investigación, se pudo observar que etapas avanzadas de la infección, el xilema se ve afectado y pierde su contorno redondeado característico, proceso que tal vez podría llevar a problemas hídricos en los tejidos. En C. citratus se observó que, por el avance progresivo de la infección y el daño celular masivo, las hojas mueren, lo cual conlleva a la defoliación y destrucción de la planta, eventos también observados por Nelson (2008) para esta misma especie.

Ma y Shang (2009) y Kang et al., (2017) indican que el daño en los tejidos del hospedante afectado por royas, se debe principalmente al deterioro de la estructura y ultraestrucrura celular como consecuencia de la desorganización y deterioro de orgánulos como mitocondrias, cloroplastos, retículo endoplasmático, núcleo y membranas celulares. Estos daños claramente afectan la homeostasis de la célula, y en consecuencia con la necrosis y muerte de células y tejidos. Aunque en esta investigación sobre el pato-sistema C. citratus-P. nakanishikii no se realizó observación ultraestructural por microscopía electrónica de trasmisión, es muy probable que el progresivo deterioro celular que se apreció tenga el mismo origen descrito por estos autores. También se debe tener en cuenta que los efectos histopatológicos sobre el hospedante e incluso sobre el patógeno, están afectados por las relaciones de resistencia y susceptibilidad entre planta y patógeno (compatibilidad e incompatibilidad). En este sentido, no existe información sobre estas relaciones en el pato-sistema C. citratus-P. nakanishikii.

La autofluorescencia observada de las secciones sanas y frescas de C. citratus utilizando radiación UV del material sano, muestra una fuerte señal en la longitud de onda correspondiente al rojo de los tejidos fotosintéticos y que es congruente con la fluorescencia endógena de la clorofila, indicando el buen estado fisiológico y vigor de los tejidos. Estos datos son similares a los registrados por otros autores quienes enfatizan la importancia de la autofluorescencia de las biomoléculas presentes en los tejidos vegetales como bioindicadores fisiológicos de salud de la planta en condiciones óptimas de desarrollo que, sin embargo, puede verse afectada cuando las plantas se enfrentan a estrés biótico o abiótico (Roshchina, 2012; García et al., 2015; Talomond, Verdeil, & Conéjéro, 2015). Estos mismos autores indican que las biomoléculas como la cutina, las ceras epicuticulares y los compuestos polifenolicos como la lignina, pueden generar autofluorescencia en la longitud de onda azul claro cuando se irradian con luz UV. Esto se evidenció para las células epidérmicas y los tejidos esclerenquimáticos de C. citratus. Sin embargo, este mismo patrón de autofluorescencia azul claro fue patente en los tejidos con paredes primarias como el parénquima y el floema, no siendo característica común este tipo de tejidos y que podría ser causado por la presencia de ácido ferúlico que está presente en todos los tejidos de las gramíneas o también por la lignificación parcial de los tejidos parenquimatosos no fotosintéticos presentes en el mesófilo foliar (Harris & Hartley, 1976; Lichtenthaler & Schweiger, 1997; Hatfield, Rancour, & Marita, 2017; Lewinsohn et al., 1998; V. Roshchina, comunicación personal, abril 2019).

Mahlein, Steiner, Hillnhütter, Dehne y Oerke (2012), Mahlein (2016) y Mahlein, Kuska, Behmann, Polder y Walter (2018), determinaron que los patrones de autofluorescencia obtenidos de los tejidos vegetales son un fenómeno complejo que depende de múltiples factores biofísicos e interacciones bioquímicas y que son fuertemente influenciados principalmente por los pigmentos presentes en el tejido, entre estos, el más importante, la clorofila. Los cambios de estos patrones de reflectancia de los tejidos pueden ser afectados durante los procesos de infección y crecimiento de los patógenos que pueden afectar la estructura o la composición química de los mismos. En este sentido los hallazgos de esta investigación concuerdan con las observaciones hechas por estos autores, ya que se evidenció la perdida de la autofluorescencia de la clorofila en la longitud de emisión correspondiente al rojo en los tejidos afectados por la infección causada por P. nakanishikii, lo cual refleja el compromiso y daño de los tejidos fotosintéticos y el afecto adverso sobre los cloroplastos durante el proceso de patogénesis. El efecto de los patógenos biotróficos como las royas sobre la fotosíntesis y los contenidos de clorofila, han sido observados en varios grupos de plantas, incluidas las gramíneas (Scholes & Rolfe, 2009; Zhao, Glynn, Glaz, Comstock, & Sood, 2011; Abdulbagiyeva, Zamanov, Talai, & Allahverdiyev, 2015; Walters, 2015). Es interesante indicar que en C. citratus los tejidos parenquimatosos de pared primaria de las regiones afectadas por la necrosis celular debido al desarrollo de la roya pierden la autofluorescencia azul claro característica y que probablemente se puede atribuir a la lignificación parcial y/o la presencia de ácido ferúlico en estas células; reflejando el efecto del patógeno sobre este tipo de moléculas presentes en la pared celular (Mahlein et al., 2018).

Sphaerellopsis filum (Biv. ex Fr.) B. Sutton es una especie registrada como un hiperparásito que está asociado con unas 369 especies de royas que parasitan principalmente los urediosoros y ocasionalmente los teliosoros. Sphaerellopsis filum es observado comúnmente como anamorfo que produce picnidios oscuros erupentes de ostiolo central, con picnidiosporas hialinas de paredes lisas y de contorno fusiforme. Los picnidios se encuentran unidos estrechamente a los urediosoros en donde parasitan las hifas que dan sustento al mismo (Yuan, Pei, Hunter, & Royle, 1998; Płachecka, 2005; Trakunyingcharoen, et al., 2014). Todas estas observaciones registradas por estos autores son congruentes a lo observado para el hiperparásito en los urediosoros de P. nakanishikii en las hojas de C. citratus, los datos morfológicos observados sugieren su circunscripción taxonómica. Sin embargo, para aclarar esta situación, sería necesario hacer investigaciones enfocadas al cultivo del hiperparásito para observar otros caracteres morfológicos de importancia taxonómica posterior corroboración molecular.

Declaración de ética: los autores declaran que todos están de acuerdo con esta publicación y que han hecho aportes que justifican su autoría; que no hay conflicto de interés de ningún tipo; y que han cumplido con todos los requisitos y procedimientos éticos y legales pertinentes. Todas las fuentes de financiamiento se detallan plena y claramente en la sección de agradecimientos. El respectivo documento legal firmado se encuentra en los archivos de la revista.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a las siguientes instituciones: al laboratorio de Investigación e Innovación en Biotecnología Agroambiental (LIIBAAM) de la Universidad de Santander (UDES), al Laboratorio de Biotecnología de la Universidad de Antioquia (UdeA) por su apoyo en la visualización de las muestras en microscopía fotónica, al Laboratorio de Microscopía Electrónica de Barrido, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) por la ayuda con las imágenes en SEM. También a Roberto Enrique Llanos-Romero del Laboratorio de Química. Departamento de ecología y recursos naturales. Facultad de Ciencias, (UNAM) por su ayuda con las secciones bilingües del manuscrito. A Victoria Vladimirovna Roshchina del Institute of Cell Biophysics of Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia, Laboratory of Microspectral Analysis of Cells and Cellular Systems por sus valiosos comentarios sobre la presencia del acido Ferúlico en granmíneas y a Mauricio Alberto Salazar Yepes Universidad Nacional de Colombia-Sede Medellin por sus acertados comentarios al manuscrito.

RESUMEN

Introducción: Los aspectos histopatológicos e histoquímicos relacionados con el ataque de royas en plantas, así como su relación con los diferentes estados espóricos, son escasos en la literatura científica. Objetivos: describir y analizar los aspectos histopatológicos e histoquímicos en Cymbopogon citratus y su relación con los diferentes estados espóricos de la roya Puccinia nakanishikii. Métodos: durante abril y agosto 2013 se recolectaron hojas sanas e infectadas con Puccinia nakanishikii en la escarpa noroccidental de la meseta de Bucaramanga-Colombia. Las muestras con lesiones en diferentes etapas del desarrollo se fijaron y procesaron de acuerdo a protocolos estándar para la inclusión y corte en parafina y resina. Las secciones obtenidas en parafina (5-7 µm) fueron teñidas con Safranina-azul de Alcian y azul de Alcian-Hematoxilina. En tanto que las secciones obtenidas en resina (0.5 µm) se tiñeron con azul de Toluidina. También se elaboraron secciones a mano alzada para análisis de autofluorescencia. Las observaciones y registro fotográfico se efectuaron con microscopio fotónico y microscopía de epifluorescencia. Para observaciones con microscopía electrónica de barrido (MEB), las muestras se fijaron en Glutaraldehído, se deshidrataron con 2,2 dimetoxipropano, se desecaron a punto crítico y se metalizaron con oro. Resultados: las hojas son por lo general hipostomáticas, con células epidérmicas largas y cortas formando filas paralelas y con la presencia de tricomas unicelulares espinosos y microtricomas. La superficie abaxial está cubierta por una densa capa de ceras epicuticulares y la adaxial está formada por agrupaciones de células buliformes y células epidérmicas de contorno rectangular o cuadrado. En el mesófilo no hay diferenciación entre parénquima de empalizada y esponjoso y su anatomía refleja el metabolismo C4 presente en esta gramínea. Se observó la formación de urediosoros y teliosoros hipófilos. Las urediosporas son la fase de reinfección y estas tienen de 4-5 poros germinativos ecuatoriales y su pared es equinulada. Las teliosporas son de pared lisa y de pedicelo persistente. Las urediosporas forman tubos de geminación por lo general sobre la superficie abaxial de la hoja y se desarrollan en dirección de los estomas, por donde penetran al interior del mesófilo. No se observó la presencia de apresorios. La epidermis se desprende y levanta por del desarrollo de las urediosporas y las paráfisis capitadas, a medida que el urediosoro crece. Con el avance de la infección, los tejidos fotosintéticos se desorganizan, pierden la autofluorescencia de la clorofila y las células sufren necrosis. Posteriormente, los tejidos vasculares se fragmentan y colapsan. Para este momento, la infección se ha extendido sobre toda la lámina foliar llevando a la muerte de la hoja y defoliación de la planta. Durante etapas avanzadas de la infección en los urediosoros se observaron picnidios, probablemente del hiperparásito Sphaerellopsis, asociados estrechamente a los tejidos infectados por la roya. Conclusiones: Puccinia nakanishikii se desarrolla sobre las hojas de Cymbopogon citratus produciendo urediosoros y teliosoros. Las urediosporas son la fase de reinfección, y las teliosporas solo se observaron en etapas avanzadas de la infección. La epidermis y los tejidos fotosintéticos son severamente afectados por la necrosis celular. En etapas avanzadas de la infección los tejidos vasculares se ven afectados.

Palabras clave: alteraciones histopatológicas, royas, teliosporas, ultrastructura, urediniosporas.

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