23
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
Actividad antimicrobiana de propóleos de abejas sin aguijón
en combinación con ajo, Allium sativum (Amaryllidaceae)
Julieta Grajales Conesa
1
, Julián Elías Chirino
1
, Eduardo Lozano Guzmán
2
,
Francisco Moreno Cruz
2
, Víctor Albores Flores
1
* & Alfonso López García
1
1. Instituto de Biociencias (IBC), Universidad Autónoma de Chiapas. Blvd. Príncipe Akishino s/n, Col. Solidaridad
2000. Tapachula Chiapas, México; jugrajco79@gmail.com, javierelias_c@hotmail.com, alboresflores@gmail.com,
josealoga@hotmail.com
2. Laboratorio de Farmacognosia, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Juárez del Estado de Durango, Av.
Veterinaria s/n, Circuito Universitario, Col. Valle del Sur, Durango, México; elozano@ujed.mx; jmoreno@ujed.mx
* Correspondence
Recibido 27-III-2020. Corregido 11-VIII-2020. Aceptado 30-IX-2020.
ABSTRACT. Stingless bees propolis antimicrobial activity in combination with garlic, Allium sativum
(Amaryllidaceae). Introduction: The excessive use of antibiotics has increased pathogenic microorganisms
resistance, which derives in patient mortality. Therefore, the strategies for searching new natural and unconven-
tional strategies has become constant and important. Objective: To determine the antimicrobial activity against
methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) against stingless bees propolis. Methods: We evaluated
nine (20 %) propolis from stingless bees ethanolic extracts from different regions: Melipona beecheii, Melipona
solani, Tetragonisca angustula and Scaptotrigona mexicana. The chemical characterization was performed by
liquid chromatography (HPLC) and microbial resistance tests by the macrodilution method, to determine the
effect of the combinations. Results: The compounds that were of interests and the most abundant were the
following; hydroxycinnamic acids, flavanones, flavonoids and the glycosylated derivatives. Four of the nine
propolis were effective against MRSA, which came from the following species; one from M. solani and three
from S. mexicana. The minimum inhibitory concentration for S. mexicana was in the range of 3-8 mg mL-1 and
for M. solani it was 4 mg mL-1. Isobolographic studies resulted in an additive effect (ɤ = 1) for the combination
of Allium sativum with the S. mexicana propolis sambles and an antagonistic effect (ɤ > 1) for the combination of
A. sativum with the propolis of M. solani. Conclusions: the combination of extracts with lower concentrations of
A. sativum, may be the most effective, than those that were individually tested. More detailed studies are required
to define the mechanisms of stingless bees propolis as well as their combination with other organic substances.
Key words: extracts; Meliponini; stingless bees; Staphylococcus aureus; isobolograms; inhibition.
Hasta el 2014, las principales causas de
morbilidad han sido las enfermedades infec-
ciosas, los tres primeros lugares los han ocu-
pado las infecciones respiratorias agudas, las
infecciones intestinales por otros organismos y
las de vías urinarias (Soto, Moreno, & Pahua,
2014). El uso excesivo de antibióticos para
tratar estas infecciones ha traído el aumento de
resistencia de los microorganismos reducien-
do las posibilidades de tratamientos eficaces
y aumento en el riesgo de mortalidad de los
pacientes (Andersson & Hughes, 2011; Serra,
2017). Por lo consiguiente, la búsqueda de nue-
vas estrategias naturales y no convencionales
Grajales Conesa, J., Elías Chirino, J., Lozano Guzmán, E., Albores Flores, V., & López
García, A. (2021). Actividad antimicrobiana de propóleos de abejas sin aguijón
en combinación con ajo, Allium sativum (Amaryllidaceae). Revista de Biología
Tropical, 69(1), 23-35. DOI 10.15517/rbt.v69i1.41241
ISSN Impreso: 0034-7744 ISSN electrónico: 2215-2075
DOI 10.15517/rbt.v69i1.41241
24
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
se ha vuelto constante (Morroni et al., 2018).
Estudios recientes han demostrado que los
propóleos son una fuente de compuestos bio-
activos con distintas actividades; antibacterial,
fungistática, antiviral, antioxidante, antiinfla-
matoria, citotóxica y anticancerígena (Sartori et
al., 2012, Popova, Chinou, Marekov, & Banko-
va, 2013, Choudhari, Haghniaz, Rajwade, &
Paknikar, 2013, Inui et al., 2014, Wang et al.,
2014, Nina et al., 2015).
Los propóleos es una substancia que las
abejas utilizan para construir y proteger la col-
mena. Es elaborado a partir de savias, resinas,
gomas y mucílagos de plantas mezcladas con
cera y secreciones bucales (Massaro, Simpson,
Powell, & Brooks, 2015). Se ha encontrado
que algunas especies de abejas neotropicales
recolectan barro para agregarlo a la mezcla
(Araújo et al., 2015). Por lo tanto, la zona geo-
gráfica y las plantas de origen determinarán la
composición química de los propóleos (Santos
et al., 2017). En diversos estudios enfocados
en su caracterización química, se han reportado
aproximadamente 300 compuestos, destacando
los flavonoides, terpenos y fenoles (Huang,
Zhang, Wang, Li, & Hu, 2014).
Por otro lado, existen otras fuentes natura-
les para la obtención de compuestos bioactivos
que también pudieran combatir resistencias
microbianas como es el caso de ajo (Allium
sativum) y otras plantas de la familia Allium.
La alicina, alina y otros compuestos ricos en
azufre, incluyendo compuestos fenólicos de
alta reactividad, son componentes principales
de A. sativum con propiedades antibacterianas
(Guillamón, 2018).
Una de las posibilidades para mejorar el
espectro de acción de las terapias actuales es
el uso combinado de antibióticos, conven-
cionales y no convencionales, con fuentes
naturales (Amber, Aijaz, Immaculata, Luqman,
& Nikhat, 2010, Chanda & Rakholiya, 2013,
Ushimaru, Barbosa, Fernández, Stasi, & Júnior,
2012, Lozano et al., 2013).
En ensayos in vitro con Staphylococcus
aureus meticilina resistente (SARM), en la com-
binación de extracto de propóleos de Apis melli-
fera con ajo (Allium sativum) se han encontrado
efectos inhibitorios sinérgicos (Rajic-Savic &
Valovic; 2009, Moreno-Cruz et al., 2014).
Sin embargo, dado que no hay reportes de
estudios del efecto que tienen los propóleos
producidos por abejas sin aguijón en com-
binación con ajo sobre SARM, el presente
estudio tiene como objetivo evaluar la activi-
dad antimicrobiana de propóleos producidos
por abejas sin aguijón en combinación con
extractos de ajo (Allium sativum), específica-
mente contra Staphylococcus aureus resistente
a meticilina (SARM).
MATERIALES Y MÉTODOS
Propóleos: Se obtuvieron nueve muestras
de propóleos a través de la “Asociación de
Meliponicultores del Soconusco S.C. de R.
L.”, ubicados en los municipios de la región del
Soconusco en: Tapachula (Rancho “San Juan”
Viva México (RSJ): (14°54’00” N & 92°19’01”
O), Cantón la pita rancho agroecológico “Ayol”
(TAP) (14°49’46” N & 92°17’42” W), Tuxt-
la Chico (Izapa I; TCIa e Izapa II; TCIb)
(14°54’19” N & 92°11’19” W), Cacahoatán
(CAC): (15°0’13” N & 92°10’6”W) y Mazatán
(MAZ): Rancho “El cocal II” (14°50’22.2” N
& 92°10’58.6” W).
Las especies de abejas sin aguijón y el
sitio de muestreo fueron los siguientes: Meli-
pona beecheii (MbTAP, MbTCIa), M. solani
(MsTCIa), Tetragonisca angustula (TaRSJ)
y Scaptotrigona mexicana (SmTAP, SmRSJ,
SmCAC, SmMAZ, SmTCIb). Las muestras se
colectaron con herramientas de acero inoxida-
ble previamente esterilizadas, tomando apro-
ximadamente 50 g de propóleos. Las muestras
fueron trasladadas al laboratorio y conservadas
en refrigeración a 4-8 °C.
Extractos: A todas las muestras de pro-
póleos se les retiraron, manualmente, los resi-
duos de plantas, insectos y trozos de maderas
desprendidos de la caja al momento de la
recolecta. Se pesaron 30 g de propóleos y se
depositaron en frascos estériles protegidos de
la luz con 100 mL de etanol grado HPLC (Fer-
mont
®
) (99.5 %). Se agitaron manualmente
25
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
por un lapso de 15 min durante 8 días. Poste-
riormente, el contenido de los frascos se filtró
a través de papel Whatman No. 41. Para la
elaboración de los extractos de ajo, los frutos
se adquirieron en el mercado local. Una vez
retirada la cáscara fueron cortados en trozos de
1 cm. Se pesaron 30 g de ajo y fueron deposi-
tados en frascos protegidos de la luz con 100
mL de etanol (99.5 %) por ocho días. Luego
fueron filtrados tal como se describe para los
propóleos. Todos los extractos se almacenaron
en refrigeración a 4-8 °C (Lozano et al., 2013,
Moreno et al., 2014).
Caracterización química: La caracteri-
zación química de los propóleos se determinó
por medio de Cromatografía Líquida de Alta
Resolución en un equipo Agilent 1 200 (con
bomba binaria y autoinyector). Las condiciones
de operación fueron: temperatura de columna
25 °C, flujo de fase móvil de 1 mL/min, en
relación 35:65 v/v. Volumen de inyección 2
µL. Fragmentador a 135 V. Modo Scan. Rango
de masas de 100 a 1 000. Polaridad positiva
y negativa. Modo de ionización electroespray
ESI. Temperatura de gas secante a 200 °C.
Flujo de gas de 13 L/min y nebulizador a 2 atm.
Tiempo de corrida de 20 min. Cada 5 min se
realizó la lectura correspondiente para obtener
los compuestos de los propóleos hasta comple-
tar una corrida total de 20 min.
Preparación del inóculo: Se utilizaron
cultivos de SARM provenientes del laborato-
rio de la Facultad de Ciencias Químicas de la
UJED previamente caracterizadas con base a
lo establecido por el Clinical and Laboratory
Standards Institute (2013). Al momento del
estudio, las cepas se encontraban preservadas
a -20 °C en medio Skim Milk. Las cepas se
activaron resembrándolas en caldo Mueller-
Hinton durante 24 h a 35 ºC. Posteriormente
se sembró por extensión en placas de Petri con
agar Mueller-Hinton adicionadas con 2 % de
NaCl para aumentar la selectividad del medio
y se incubaron por 24 h a 35 ºC. Finalmente, se
tomaron cinco colonias y se suspendieron en
100 mL de caldo Mueller-Hinton adicionado
con NaCl al 2 %. La determinación de la
concentración celular se realizó por conteo al
microscopio en cámara de Neubauer.
Estudio de inhibición: Se siguió el méto-
do de macrodilución (Taroco, Seija, & Vignoli,
2006). Con base a trabajos previos (Lozano et
al., 2013; Moreno et al., 2014), se ensayaron
seis rangos de dilución: 1:4, 1:8, 1:16, 1:32,
1:64 y 1:128 (v/v) para los extractos de pro-
póleos y para el extracto de ajo se ensayaron
siete rangos de dilución: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16,
1:32, 1:64 y 1:128 (v/v). Se depositó 1 mL de
caldo Mueller-Hilton estéril como diluyente en
cada tubo. Posteriormente se depositó 1 mL del
extracto correspondiente en el primer tubo de la
serie, se agitó y se transfirió 1 mL al siguiente
tubo hasta llegar al sexto tubo. Al último tubo
de la serie se le extrajo 1 mL y se desechó. Al
final, se depositó 1 mL de inoculo en cada tubo
para lograr las concentraciones de los extractos
antes mencionadas. Se agitaron los tubos y se
dejaron reposar durante 20 min para que el
extracto funcionara. Posterior a esto, se sem-
braron 10 μL de cada tubo en placas con agar
Mueller-Hinton adicionadas con NaCl al 2 %.
Tanto los tubos como las placas. Para descartar
el efecto inhibitorio del etanol, se realizó el
mismo proceso sustituyendo tanto los extractos
de propóleos como de ajo, por etanol. Todas
las pruebas se hicieron por triplicado. Después
del tiempo de incubación se contabilizaron las
colonias crecidas en placas para determinar la
población expresada como UFC x 10
6
.
Concentración mínima inhibitoria,
concentración mínima bactericida y con-
centración efectiva 50: Para determinar la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se
leyó la absorbancia a los tubos inoculados por
espectrometría a una longitud de onda de 625
nm, usando como “blanco” caldo estéril. Esto
se realizó para cada una de las repeticiones.
Por otra parte, se realizó el conteo de colo-
nias en placa y se reportó como UFCx10
6
mL
-1
.
Se estableció como Concentración Mínima
Bactericida (CMB) aquella concentración a la
cual no hubiera crecimiento en placa.
26
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
La concentración efectiva 50 (CE50) se
calculó de la siguiente forma: a) en cada caso
se determinó la mortalidad como la diferencia
entre la población inicial (inóculo) y la conta-
bilizada en la placa a cada concentración de
antibiótico. b) se denominó al porcentaje de
efecto (PE) como la relación entre la media
de la mortalidad para las tres corridas en
cada concentración y el inóculo expresado
en porcentaje. c) Para obtener la curva dosis-
respuesta se realizó un gráfico del log de las
concentraciones en el eje de las abscisas y el
PE en el eje de las ordenadas obteniéndose una
recta. Con ello, se determinó la ecuación de la
recta correspondiente. d) Finalmente, con dicha
ecuación se calculó la concentración a la cual
se obtendría el 50 % de efecto (CE50). Para
expresar las CMI, CMB Y CE50 en mg mL
-1
, se colocaron 5 mL de cada extracto en una
termobalanza a 36 °C durante 90 min. Se reali-
zaron lecturas cada 10 min hasta observar que
ya no había cambios en el peso. Esto se realizó
por triplicado.
Análisis de datos: Las medias de la con-
centración mínima inhibitoria (CMI) para la
combinación de extractos de propóleos y ajo,
y concentración mínima bactericida (CMB) de
los diferentes tratamientos fueron sometidos a
un ANOVA para determinar diferencia entre las
medias de los tratamientos y en los que hubo
diferencia se realizó un contraste de dichas
medias con prueba Tukey a través del Software
estadístico Infostat 2015.
Combinaciones: Se utilizó la técnica para
estudios isobolográficos descrita por Tallarida
en 2001. La línea se estableció con base a la
CE
50
promedio de la cepa SARM, como se des-
cribió líneas arriba. Según la técnica citada, al
combinar un antimicrobiano A, la dosis de 50
% (CE50 - punto A en la Fig. 1) con una dosis
igual de 50 % de otro antimicrobiano B (punto
B), se obtiene un efecto conjunto del 100 %, es
decir, equivalente al obtenido por cualquiera de
ellos si se administrara de forma independiente.
La línea que une ambos puntos se denomina
“línea de aditividad” o “isobola” (Fig. 1).
Para evaluar un posible efecto sinérgico
se ensayaron las combinaciones descritas en la
Tabla 1. Con los resultados obtenidos, se deter-
minaron las CE50e de las mezclas, así como
las concentraciones individuales (Tabla 2). Las
medias de las CE50 calculadas se compararon
Fig. 1. Isobolograma, línea de aditividad. / Fig. 1. Isobologram, additivity line.
27
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
con las CE50e para verificar si fueron dife-
rentes mediante la prueba “t” Student para
datos independientes. Posteriormente se calcu-
ló el índice de interacción (ɤ) con estos datos,
mediante la siguiente ecuación:
ɤ = a/A + b/B
Donde: A = Concentración de propóleos admi-
nistrado en forma individual que presenta el
100 % de inhibición.
B = Concentración de Allium sativum adminis-
trado en forma individual que presenta el 100
% de inhibición.
a y b = Concentraciones de cada antimicrobia-
no usadas en la combinación
Si ɤ es igual a 1, se tiene un efecto simple
aditivo, si es mayor que 1 el efecto se considera
antagónico. Finalmente, si ɤ es menor que 1 y
la prueba “t” arroja diferencias significativas,
se considera un efecto sinérgico.
RESULTADOS
Caracterización química de los propó-
leos: Los resultados de análisis por HPLC/MS/
MS de los distintos propóleos se muestran en
la Tabla 3. Se tomó como ion de referencia el
ácido ferúlico debido a que presentó la mayor
abundancia iónica. Los propóleos de abejas
sin aguijón llegaron a contener alrededor de
16 compuestos, los cuales pertenecen a los
ácidos orgánicos y derivados de los terpenos,
y se presentaron en mayor proporción respec-
to al ion de referencia. El ácido ferúlico fue
identificado en todas las muestras, mientras
TABLA 1
Combinaciones teóricas usadas en el estudio Isobolográfico expresados en mg mL
-1
TABLE 1
Theoretical combinations used in the Isobolographic study expressed in mg mL
-1
A.s.
SmRSJ
A.s.
SmMAZ
A.s.
SmTCIb
A.s.
MsTCla
Combinación zt Combinación zt Combinación zt Combinación zt
4.2 1.7 4.2 2.7 4.2 1 4.2 1.40
2.1 0.85 2.95 2.1 1.35 3.45 2.1 0.5 2.6 2.1 0.70 2.8
1.05 0.425 1.47 1.05 0.33 1.72 1.05 0.25 1.3 1.05 0.35 1.4
A.s.: Allium sativum; zt: suma de ambos extractos.
zt: sum of both extracts.
TABLA 2
Combinaciones experimentales expresadas en mg mL
-1
e índice de interacción ɤ
TABLE 2
Experimental combinations expressed in mg mL
-1
and interaction index ɤ
A.s.
SmRSJ
A.s.
SmMAZ
CE50 Zmix Zt ɤ CE50 Zmix Zt ɤ
0.0021 0.0008 0.0029 2.95 1 1.0174 1.5826 2.6 3.45 1
A.s.
SmTClb
A.s.
MsTCla
CE50 Zmix zt ɤ CE50 Zmix Zt ɤ
0.0113 0.0027 0.014 2.6 1 4.6385 1.5615 6.2 2.8 0.3
A.s.: Allium sativum.
Zmix: Combinación efectiva 50 experimental; Zt: Combinación efectiva 50 teórica; Índice de interacción (ɤ): ɤ = 1, efecto
aditivo, ɤ < 1, efecto sinérgico y ɤ > 1, efecto antagónico.
Zmix: Experimental effective combination 50; Zt: Theoretical 50 effective combination; Interaction index (ɤ): ɤ = 1, additive
effect, ɤ < 1, synergistic effect and ɤ > 1, antagonistic effect.
28
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
que la naringenina y totarolona fueron detecta-
dos en siete de las nueve muestras recolectadas.
Estudio de inhibición: Los resultados
muestran que cuatro de los nueve extractos
evaluados contra SARM fueron eficaces para
inhibir el crecimiento de la bacteria durante
las 24 h de la prueba (Tabla 4). Estos extractos
pertenecen a las abejas sin aguijón Melipona
solani (MsTCla) y Scaptotrigona mexicana
(SmRSJ, SmMAZ y SmTCIb). El análisis esta-
dístico no mostró diferencias entre los cuatro
propóleos que resultaron positivos para inhibir
a SARM (P > 0.05).
TABLA 3
Compuestos identificados en las nueve muestras de propóleos a través de HPLC-QQQ/MS/MS
TABLE 3
Compounds identified in the nine propolis samples via HPLC-QQQ / MS / MS
Grupo Masa IP m/z
1
Compuesto Ocurrencia
2
ÁCIDO
1 149 (-)148.8 Ácido cinámico; Ácido (E)-3-fenil-2-propenoico 9
2 181 181 Ácido cafeíco; Ácido (E)-3-(3,4-dihidroxifenil)prop-2-enoico 2, 8, 9
3 193 (+)194.20 Ácido ferúlico; Ácido (E)-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)propil-
2-enoico
1,2,3,4,6,7,8,9
CUMARINA
4 244 244.29
Suberosina; 7-Metoxi-6- (3-metilbut-2-enil) cromen-2-ona
4,6
FLAVONOIDE
5 253 (+)254.20
Crisina; 5,7-Dihidroxi-2-fenil-4H-cromen-4-ona
9
6 422 422.47
Macarangina; 6-[(2E)-3,7-dimetilocta-2,6-dienil]-3,5,7-
trihidroxi-2-(4-hidroxifenil)cromen-4-ona
4,7,8,9
FLAVANONA
7 255 255.30
Pinocembrina; 5,7-Dihidroxi-2-fenil-2,3-dihidro-4H-cromen-
4-ona
2,3,6,8,9
8 272 272.20
Naringenina; 5,7-Dihidroxi-2-(4 hidroxifenill)croman-4-ona
2,3,5,6,7,8,9
FLAVONA
9 269 (+)271.8
Apigenina; 5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)cromen-4-ona
3,9
DITERPENO
10 301 (-)300.70
Totarolona; 7-hidroxi-1,1,4a-trimetil-8-propan-2-il-
4,9,10,10a-tetrahidro-3H-fenantren-2-ona
1,2,5,7,8,9
TERPENOIDE
11 314 314.29
Odoratina; 7-hidroxi-3-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-6-
metoxicromen-4-ona
4,8,9
NO IDENTIFICADO
12 550.3 1,3,4,6,7,8,9
13 633.1 1,3,4,6,7,8,9
14 702.5 2,3,6,9
15 727.70 1,3,4,6,7,8,9
16 734.70 1,3,4,6,7,8,9
1. Iones principales m/z: positivo [M+H]
+
y negativo [M+H]
-
;
2
Presencia: Los números representan la presencia del
compuesto en los extractos de propóleos. Las claves son las siguientes; MbTAP (1), MbTCIa (2), MsTCla (3), TaRSJ
(4), SmTAP (5), SmRSJ (6), SmCAC (7), SmMAZ (8) y SmTCIb (9).
1. Principal m / z ions: positive [M + H] + and negative [M + H] -;
2
Occurrence: The numbers represent the presence of the
compound in the propolis extracts. The keys are as follows: MbTAP (1), MbTCIa (2), MsTCla (3), TaRSJ (4), SmTAP
(5), SmRSJ (6), SmCAC (7), SmMAZ (8) y SmTCIb (9).
29
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
Todos los propóleos a la dilución 1:4
tuvieron una concentración mínima inhibi-
toria (CMI) de 4 mg mL
-1
(MsTCla), 5 mg
mL
-1
(SmRSJ), 8 mg mL
-1
(SmMAZ) y 3 mg
mL
-1
(SmTClb). La concentración efectiva 50
(CE50) fue de 1.41, 1.7, 2.7 y 1 mg mL
-1
res-
pectivamente. En el caso de Allium sativum, se
registró una CMI de 9 mg mL
-1
y la CE50 de
4.2 mg mL
-1
(Tabla 4) de acuerdo a lo descrito
en la sección de materiales y métodos.
Combinaciones: Como se observa en los
isobologramas (Fig. 2), para los cuatro extrac-
tos existe diferencia entre la combinación
efectiva 50 teórica (CE50t) y la experimental
(CE50e). El punto P representa la CE50t mien-
tras que el punto Q representa la CE50e. Para
el caso de la CE50e de los extractos de SmRSJ,
SmMAZ, SmTClb, esta se encuentra por deba-
jo de la línea de aditividad lo que significaría
Fig. 2. Isobologramas de los extractos de propóleos. Punto rojo: Concentración efectiva 50 teórica (zt). Punto negro:
Concentración efectiva experimental (zmix).
Fig. 2. Isobolograms of propolis extracts. Red dot: Theoretical effective concentration 50 (zt). Black point: Experimental
effective concentration (zmix).
TABLA 4
Porcentaje de inhibición de los extractos de propóleos contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM),
concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración efectiva 50 (CE50) expresada en mg mL-1
TABLE 4
Inhibition percentage of propolis extracts against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), minimum
inhibitory concentration (MIC) and effective concentration 50 (EC50) expressed in mg mL-1
[Ext] MbTAP MbTCIa TaRSJ SmTAP SmCAC MsTCla SmRSJ SmMAZ SmTCIb As
20 % X X X X X 100 100 100 100
CMI 4 5 8 3 9
CE50 1.41 1.7 2.7 1 4.2
La ‘‘X’’ representa que no hubo inhibición contra SARM; [Ext]: Concentración del extracto; As: Allium sativum; M. solani
(MsTCla) y S. mexicana (SmMAZ, SmTClb, SmTClb).
The ‘‘X’’ represents that there was no inhibition against MRSA; [Ext]: Concentration of the extract; As: Allium sativum; M.
solani (MsTCla) and S. mexicana (SmMAZ, SmTClb, SmTClb).
30
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
que la combinación de ambos extractos. Sin
embargo, la CE50e de MsTCla se encontró por
encima de la línea de aditividad, esto signifi-
caría que la combinación de ambos extractos
produciría un efecto adverso en comparación
de la aplicación individual tanto del propóleos
como de Allium sativum.
DISCUSIÓN
Los compuestos encontrados en los propó-
leos de abejas sin aguijón han sido reportados
con actividad antimicrobiana y descritos mayo-
ritariamente para propóleos de Apis mellifera
(Bankova, De Castro, & Marcucci, 2000; Mar-
cucci et al., 2001; Ristivojević et al., 2016).
El ácido cinámico, cafeíco y ferúlico se
encuentran como constituyentes habituales en
la composición química de los propóleos, prin-
cipalmente los que se producen en regiones
tropicales como Brasil (Dos Santos, Bicalho,
& de Aquino Neto, 2003; Salomão et al., 2004;
Sawaya, Souza, Marcucci, Cunha, & Shimizu,
2004). Además de estos ácidos aromáticos,
también se encuentran los flavonoides y sus
derivados tales como la crisina, macarangi-
na, naringenina, pinocembrina y apigenina,
compuestos recurrentes en la mayoría de los
propóleos de A. mellifera y las abejas sin
aguijón (Silici & Kutluca, 2003, Ahn, Kuma-
zawa, Hamasaka, Bang, & Nakayama, 2004,
Kumazawa, Hamasaka, & Nakayama, 2004,
Lotti et al., 2010).
Los terpenos y sus derivados son otra clase
de compuestos que comúnmente se encuen-
tran dentro del perfil químico. La totarolona
y odoratina han sido reportados en propóleos
griegos (Popova, Dimitrova, Al-Lawati, Tsve-
tkova, Najdenski, & Bankova, 2009) y de
Népal (Shrestha, Narukawa, & Takeda, 2007).
Estos resultados concuerdan con los obtenidos
en este trabajo, ya que la mayoría de los pro-
póleos cuentan con la presencia de uno o más
compuestos similares. Sin embargo, la relación
en la que están dentro de la composición quí-
mica de cada propóleos resulta en caracterís-
ticas específicas para cada uno (Bonvehí &
Coll, 1994). Del compuesto doce al dieciséis
no lograron ser identificados, sin embargo, se
encuentran en la mayoría de todos los extrac-
tos, por lo que la identificación podría llevarse
a cabo en futuras investigaciones. La subero-
sina, una lactona del ácido hidroxicinámico,
ha sido reportada en propóleos de zonas como
Argelia (Boutabet, Kebsa, Alyane, & Lahouel,
2011), Brasil (De Castro, 2001) e Irán (Trushe-
va et al., 2010).
Los valores de CMI encontrados en este
estudio son similares a los reportados por otros
autores, tanto para propóleos de A. mellifera
como para las abejas sin aguijón. Estos valores
van desde los 0.0025 mg mL
-1
hasta los 9 mg
mL
-1
(Fernandes, Leomil, Fernades, & Sforcin,
2001, Miorin, Levy Junior, Custodio, Bretz &
Marcucci, 2003, Castro et al., 2009). Tal es
el caso del estudio realizado con M. orbignyi
donde reportan una CMI de 3.1 mg mL
-1
contra
S. aureus (Campos et al., 2014), este resultado
es similar a lo encontrado en el presente estudio
y que además se encuentra dentro del rango de
concentración reportado para otras especies de
Melipona como es el caso del trabajo realiza-
do con propóleos de M. scutellaris contra S.
aureus así como la cepa resistente a meticilina
el cual resultó en una CMI de 6.25-12.5 mg
mL
-
1 (Da Cunha et al., 2013). Para el caso de
Scaptotrigona, se realizó un trabajo con abejas
del género Trigona encontrándose con valores
de CMI en el rango de 1.21 a 4.87 µg mL
-1
contra tres cepas del S. aureus (Choudhari,
Punekar, Ranade, & Paknikar, 2012). Concen-
traciones menores en comparación con las CMI
encontradas en este estudio.
El efecto antibacteriano de los propóleos
evaluados en este estudio puede deberse a la
vegetación en la zona de pecoreo de las abejas
la cual influye tanto en la composición quími-
ca así como la CMI de cada propóleos (Uzel,
Önçağ, Çoğulu, & Gençay, 2005). La actividad
de los propóleos tanto en extractos acuosos
como alcohólicos puede deberse a la disolución
de los compuestos con actividad antimicro-
biana así como la volatilidad la que facilita el
contacto con la pared celular de las bacterias,
logrando así la reducción de los factores de
virulencia de estas cepas (Hazem et al., 2017).
31
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
Se ha demostrado que los propóleos son capa-
ces de inhibir enzimas como coagulasa y lipasa,
los cuales facilitan a la bacteria patógena poder
infectar al huésped (Sprin & Bankova, 2011).
Así mismo, los propóleos son capaces de actuar
a nivel de ADN, inhibiendo la replicación e
indirectamente la división celular, evitando así
la proliferación de la bacteria (Takaisi-Kikuni
& Schilcher, 1994).
Aunque existen datos sobre la actividad
antimicrobiana de los propóleos de abejas sin
aguijón, los resultados obtenidos pueden con-
siderarse como los primeros datos reportados
para M. solani y S. mexicana. Estos resultados
se deben a que los propóleos han demostrado
sinergismo entre sus componentes como se
reporta en trabajos donde se analizaron tanto de
forma integral, así como sus fracciones (Sfor-
cin, Fernandes, Lopes, Bankova, & Funari,
2000, Santos et al., 2002).
Algo similar ocurre con el ajo ya que el
mecanismo de A. sativum se basa principal-
mente en la acción de la Alicina que actúa
parcialmente a nivel de ADN inhibiendo la
síntesis de proteínas e inhibiendo totalmente
la síntesis de ARN como su principal objetivo
(Eja et al., 2007). Para el caso de Allium sati-
vum, La CMI se encuentra dentro del rango
de valores reportados por otros autores que
trabajaron tanto con extractos etanolicos como
acuosos. Estos valores pueden llegar hasta los
75 mg mL
-1
(Iwalokun, Ogunledun, Ogbolu,
Bamiro, & Jimi-Omojola, 2004, Betoni, Man-
tovani, Barbosa, Di Stasi, & Fernandes, 2006,
Abubakar, 2009). Sin embargo, la actividad
antimicrobiana de A. sativum dependerá de
la relación entre sus componentes bioactivos
como la alicina y los sulfuros. Un estudio
realizado con alicina liquida reportó que con-
centraciones bajas (< 62.5 μg mL
-1
) de dicho
compuesto, no mostró actividad antimicrobiana
contra S. aureus; mientras que a 250 μg mL
-1
o cercano a esta concentración fueron las más
activas (Cutler & Wilson, 2004). En el caso de
los sulfuros, a mayor número de puentes disul-
furos, mayor actividad antimicrobiana reflejan
los compuestos. Un trabajo realizado con aceite
de ajo reveló que una concentración alta de
tetrasulfuro de dialilo puede conllevar a una
mayor actividad antimicrobiana (Tsao & Yin,
2001). Dichos trabajos realizados pueden dar
dilucidar porqué A. sativum demostró una acti-
vidad antimicrobiana débil.
El análisis del índice de interacción mostró
un efecto aditivo para los 3 propóleos de S.
mexicana en combinación con A. sativum. Tra-
bajos donde se ha combinado el propóleos con
otras sustancias orgánicas como Lippia gra-
veolens y el propio A. sativum han resultado en
efectos sinérgicos (ɤ < 1) (Noori, Al-Ghamdi,
Ansari, Al-Attal, & Salom, 2012, Moreno et
al., 2014). Aunque el resultado que se obtuvo
no sea de carácter sinérgico, podemos decir
que la acción individual del propóleos es igual
de efectiva que en su combinación. Incluso
podría utilizarse en cantidades menores a la
CE
5O
de ambos materiales vegetales. Por otro
lado, también se han realizado trabajos de
combinación del propóleos con antibióticos
como Ciprofloxacino y Levofloxacino donde la
actividad antibacterial se vio afectada (Lozano,
López, Luis, Pacheco, & Guillén, 2014). Algo
similar ocurrió en nuestro estudio dado que
la combinación del propóleos de M. solani y
A. sativum dio como resultado un índice de
interacción menor a la unidad (0.3). Una expli-
cación a esto sería que el propóleos solo actúa
de manera positiva con otros compuestos que
actúen a nivel de pared celular y el mecanismo
de acción del propóleos de M. solani sea dis-
tinto al de A. sativum o existan otros factores
propios de dicho material que disminuyen su
actividad al estar presente a los compuestos de
A. sativum. Estas aseveraciones están basadas
en la poca información que existe con base a
la combinación del propóleos con otras sus-
tancias orgánicas por lo que se requiere seguir
investigando los mecanismos de acción en este
tipo de estudios.
El efecto aditivo en las combinaciones
demostró que de forma individual cada com-
puesto es igual de efectivo que en al realizar
la combinación, y este representa un potencial
para inhibir cepas de Staphylococcus aureus
resistente a meticilina.
32
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
Declaración de ética: los autores declaran
que todos están de acuerdo con esta publica-
ción y que han hecho aportes que justifican
su autoría; que no hay conflicto de interés de
ningún tipo; y que han cumplido con todos los
requisitos y procedimientos éticos y legales
pertinentes. Todas las fuentes de financiamien-
to se detallan plena y claramente en la sección
de agradecimientos. El respectivo documento
legal firmado se encuentra en los archivos de
la revista.
RESUMEN
Introducción: El uso excesivo de antibióticos ha
traído el aumento de resistencia en los microorganismos
patógenos que provocan mortalidad de los pacientes. Por
consiguiente, la búsqueda de nuevas estrategias naturales
y no convencionales se ha vuelto constante e importante.
Objetivo: Determinar la actividad antimicrobiana contra
Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM)
de los propóleos por abejas sin aguijón. Métodos: Nueve
fueron los extractos etanolicos de propóleos al 20 % de
las abejas sin aguijón de distintas regiones: de Melipona
beecheii, de Melipona solani, de Tetragonisca angustula
y de Scaptotrigona mexicana. Se realizó la caracterización
química de los compuestos por cromatografía liquida y las
pruebas de resistencia microbiana por el método de macro-
dilución para determinar el efecto de las combinaciones.
Resultados: Los compuestos de interés fueron detectados,
y destacan como los más abundantes los ácidos hidroxici-
námicos, flavanonas, flavonoides y sus derivados glicosi-
lados. Cuatro de los nueve propóleos resultaron efectivos
contra SARM, los cuales provinieron, uno de Melipona
solani y tres de Scaptotrigona mexicana. La CMI para S.
mexicana está en el rango de 3-8 mg mL
-1
y para M. solani
fue de 4 mg mL
-1
. Los estudios isobolográficos dieron
como resultado un efecto aditivo (ɤ = 1) para la combina-
ción de Allium sativum con los 3 propóleos de S. mexicana
y un efecto antagónico (ɤ > 1) para la combinación de A.
sativum con el propóleos de M. solani. Conclusiones: la
combinación de extractos menores puede ser más efectiva
que usando la CE50 de los extractos de forma individual.
Se requieren estudios más detallados para definir los meca-
nismos de los propóleos de las abejas sin aguijón, así como
su combinación con otras sustancias orgánicas.
Palabras clave: extractos; Meliponini; trigonas; Staphylo-
coccus aureus; isobologramas; inhibición.
REFERENCIAS
Abubakar, E. (2009). Efficacy of crude extracts of gar-
lic (Allium sativum Linn.) against nosocomial
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Strepto-
coccus pneumoniea and Pseudomonas aeruginosa.
Journal of Medicinal Plants Research, 3(4), 179-85.
Ahn, M., Kumazawa, S., Hamasaka, T., Bang, K., &
Nakayama, T. (2004). Antioxidant activity and cons-
tituents of propolis collected in various areas of
Korea. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
52(24), 7286-7292.
Amber, K., Aijaz, A., Immaculata, X., Luqman, K., &
Nikhat, M. (2010). Anticandidal effect of Ocimum
sanctum essential oil and its synergy with fluconazole
and ketoconazole. Phytomedicine, 17(12), 921-925.
Andersson, D., & Hughes, D. (2011). Persistence of
antibiotic resistance in bacterial populations. FEMS
Microbiology Review, 35(5), 901-11.
Araújo, M., Búfalo, M., Conti, B., Fernandes, Jr. A., Trus-
heva, B., Bankova, V., & Sforcin, J.M. (2015). The
chemical composition and pharmacological activities
of geopropolis produced by Melipona fasciculata
Smith in Northeast Brazil. Journal of Molecular
Pathophysiology, 4(1), 12-20.
Bankova, V., De Castro, S., & Marcucci, M. (2000). Pro-
polis: recent advances in chemistry and plant origin.
Apidologie, 31(1), 3-15.
Betoni, J., Mantovani, R., Barbosa, L., Di Stasi, L., &
Fernandes, Jr. A. (2006). Synergism between plant
extract and antimicrobial drugs used on Staphylococ-
cus aureus diseases. Memórias do Instituto Oswaldo
Cruz, 101(4), 387-90.
Bonvehí, J., & Coll, F. (1994). Phenolic composition of
propolis from China and from South America. Zeits-
chrift fur Naturforschung, 49(11-12), 712-718.
Boutabet, K., Kebsa, W., Alyane, M., & Lahouel, M.
(2011). Polyphenolic fraction of Algerian propolis
protects rat kidney against acute oxidative stress
induced by doxorubicin. Indian Journal of Nephrolo-
gy, 21(2), 101-106.
Campos, J., dos Santos, U., Macorini, L., de Melo, A.,
Balestieri, J., Paredes-Gamero, E., Cardoso, C.A., &
dos Santos, E.L. (2014). Antimicrobial, antioxidant
and cytotoxic activities of propolis from Melipona
orbignyi (Hymenoptera, Apidae). Food and Chemical
Toxicology, 65, 374-80.
Castro, M., Vilela, W., Zauli, R., Ikegaki, M., Rehder, V.,
Foglio, M., & Rosalen, P.L. (2009). Bioassay guided
purification of the antimicrobial fraction of a Brazi-
lian propolis from Bahia state. BMC Complementary
of Alternative Medicine, 9(1), 25-31.
Chanda, S., & Rakholiya, K. (2011). Combination therapy:
Synergism between natural plant extracts and antibio-
tics against infectious diseases. Microbiology Book
Series, 1, 520-529.
33
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
Choudhari, M., Haghniaz, R., Rajwade, J., & Paknikar, K.
(2013). Anticancer activity of Indian stingless bee
propolis: an in vitro study. Journal of Evidence Based
Complementary and Alternative Medicine, 2013,
1-10. DOI: 10.1155/2013/928280
Choudhari, M., Punekar, S., Ranade, R., & Paknikar, K.
(2012). Antimicrobial activity of stingless bee (Trigo-
na sp.) propolis used in the folk medicine of Western
Maharashtra, India. Journal of Ethnopharmacology,
141(1), 363-367.
Cutler, R., & Wilson, P. (2004). Antibacterial activity
of a new, stable, aqueous extract of allicin against
methicillin-resistant Staphylococcus aureus. British
Journal of Biomedical Science, 61(2), 71-74.
Da Cunha, M., Franchin, M., Galvão, L., de Ruiz, A., de
Carvalho, J., Ikegaki, M., & Rosalen, P.L. (2013).
Antimicrobial and antiproliferative activities of
stingless bee Melipona scutellaris geopropolis.
BMC Complementary and Alternative Medicine,
13(1), 23-32.
De Castro, S. (2001). Propolis: biological and pharmacolo-
gical activities. Therapeutic uses of this bee-product.
Annual Review of Biomedical Sciences, 3, 49-83.
Dos Santos, P.A., Bicalho, B., & de Aquino Neto, F. (2003).
Comparison of propolis from Apis mellifera and
Tetragonisca angustula. Apidologie, 34(3), 291-298.
Fernandes, Jr. A., Leomil, L., Fernandes, A., & Sforcin,
J. (2001). The antibacterial activity of propolis pro-
duced by Apis mellifera L. and Brazilian stingless
bees. Journal of Venomous Animals and Toxins,
7(2), 173-182.
Eja, M., Asikong, B., Abriba, C., Arikpo, G., Anwan, E.,
& Enyi-Idoh, K. (2007). A comparative assessment
of the antimicrobial effects of garlic (Allium sativum)
and antibiotics on diarrheagenic organisms. The
Southeast Asian Journal of Tropical Medicine in
Public Health, 38(2), 343-348.
Guillamón, E. (2018). Efecto de compuestos fitoquími-
cos del género Allium sobre el Sistema immune
y la respuesta inflamatoria. Ars Pharmaceutica,
59(3), 185-196.
Hazem, A., Popescu, C., Crisan, J., Popa, M., Chifiriuc,
M., Pircalabioru, G., & Lupuliasa, D. (2017). Anti-
bacterial efficiency of five propolis extracts on
planktonic and adherent microbial strains. Farmacia,
65(5), 813-818.
Huang, S., Zhang, C., Wang, K., Li, G., & Hu, F. (2014).
Recent advances in the chemical composition of pro-
polis. Molecules, 19(12), 19610-19632.
Inui, S., Hatano, A., Yoshino, M., Hosoya, T., Shima-
mura, Y., Masuda, S., & Kumazawa, S. (2014).
Identification of the phenolic compounds contribu-
ting to antibacterial activity in ethanol extracts of
Brazilian red propolis. Natural Product Research,
28(16), 1293-1296.
Iwalokun, B., Ogunledun, A., Ogbolu, D., Bamiro, S., &
Jimi-Omojola, J. (2004). In vitro antimicrobial pro-
perties of aqueous garlic extract against multidrug-
resistant bacteria and Candida species from Nigeria.
Journal of Medicinal Food, 7(3), 327-333.
Kumazawa, S., Hamasaka, T., & Nakayama, T. (2004).
Antioxidant activity of propolis of various geogra-
phic origins. Food Chemistry, 84(3), 329-339.
Lotti, C., Campo-Fernandez, M., Piccinelli, A., Cuesta-
Rubio, O., Marquez-Hernandez, I., & Rastrelli, L.
(2010). Chemical constituents of red Mexican pro-
polis. Journal of Agricultural and Food Chemical,
58(4), 2209-2213.
Lozano, E., López, O., Bocanegra, M., Davis, L., Flores,
C., & Cervantes, M. (2013) Interacción sinérgica de
propóleos (Propolis) y orégano (Lippia graveolens
Kunth sl) contra Staphylococcus aureus. Revista
Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, 44(4), 73-78.
Lozano, E., López, O., Luis, A., Pacheco, J., & Guillén, A.
(2014). Interaction between propoleum extracts and
Ciprofloxacin and Levofloxacin for the in vitro inhi-
bition of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
isolates. African Journal of Microbiology Research,
8(10), 1089-1097.
Marcucci, M., Ferreres, F., García-Viguera, C., Bankova,
V., De Castro, S., Dantas, A., & Paulino, N. (2001).
Phenolic compounds from Brazilian propolis with
pharmacological activities. Journal of Ethnopharma-
cology, 74(2), 105-112.
Massaro, C., Simpson, J., Powell, D., & Brooks, P. (2015).
Chemical composition and antimicrobial activity of
honeybee (Apis mellifera ligustica) propolis from
subtropical eastern Australia. The Science of Nature,
102(68), 11-12.
Miorin, P., Levy Junior, N., Custodio, A., Bretz, W., &
Marcucci, M. (2003). Antibacterial activity of honey
and propolis from Apis mellifera and Tetragonisca
angustula against Staphylococcus aureus. Journal of
Applied Microbiology, 95(5), 913-920.
Moreno-Cruz, F., Cervantes-Flores, M., Lopez-Guzman,
O., Vertiz-Hernández, A., Ceniceros-Medina, R., &
Lozano-Guzman, E. (2014). Synergistic interaction
of extracts of garlic (Allium sativum) and pro-
polis against methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. African Journal of Microbiology Research,
8(52), 3986-3991.
Morroni, G., Álvarez-Suarez, J., Brenciani, A., Simoni, S.,
Fioriti, S., Pugnaloni, A., … & Giovanetti, E. (2018).
Comparison of the antimicrobial activities of four
honeys from three countries (New Zeeland, Cuba,
and Kenya). Frontiers in Microbiology, 9, 1378-1387.
34
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
Nina, N., Quispe, C., Jiménez-Aspee, F., Theoduloz, C.,
Feresín, G.E., Lima, B., … & Schmeda, H.G. (2015).
Antibacterial activity, antioxidant effect and chemical
composition of propolis from the Región del Maule,
Central Chile. Molecules, 20(10), 18144-18167.
Noori, A., Al-Ghamdi, A., Ansari, M., Al-Attal, Y., &
Salom, K. (2012). Synergistic effects of honey and
propolis toward drug multi-resistant Staphylococcus
aureus, Escherichia coli and Candida albicans isola-
tes in single and polymicrobial cultures. International
Journal of Medical Science, 9(9), 793-800.
Popova, M., Dimitrova, R., Al-Lawati, H., Tsvetkova, I.,
Najdenski, H., & Bankova, V. (2013). Omani propo-
lis: chemical profiling, antibacterial activity and new
propolis plant sources. Chemistry Central Journal,
7(1), 1-8.
Popova, M., Chinou, I., Marekov, I., & Bankova, V. (2009).
Terpenes with antimicrobial activity from Cretan pro-
polis. Phytochemistry, 70(10), 1262-1271.
Rajic-Savic, N., & Valovic, J. (2009). Antimicrobial activi-
ty of propolis on the basis of preparation in relation
to Staphylococcus aureus. In The international sym-
posium on biocides in public health and environment
[and] the international symposium on antisepsis, dis-
infection and sterilization [and] Belgrade (205-206).
Serbia: Institute for Biocides and Medical Ecology.
Ristivojević, P., Dimkić, I., Trifković, J., Berić, T., Vovk,
I., Milojković-Opsenica, D., & Slavisa, S. (2016).
Antimicrobial activity of Serbian propolis evaluated
by means of MIC, HPTLC, bioautography and che-
mometrics. PloS one, 11(6), e0157097.
Salomão, K., Dantas, A., Borba, C., Campos, L., Machado,
D., Aquino, N.F., & De Castro, S.L. (2004). Chemi-
cal composition and microbicidal activity of extracts
from Brazilian and Bulgarian propolis. Letters in
Applied Microbiology, 38(2), 87-92.
Santos, F., Bastos, E., Uzeda, M., Carvalho, M., Farias,
L., Moreira, E., & Braga, F.C. (2002). Antibacterial
activity of Brazilian propolis and fractions against
oral anaerobic bacteria. Journal of Ethnopharmaco-
logy, 80(1), 1-7.
Santos, H., Campos, J., Santos, C., Balestieri, J., Silva, D.,
Carollo, C., … & Dos, S.E.L. (2017). Chemical profi-
le and antioxidant, anti-inflammatory, antimutagenic
and antimicrobial activities of geopropolis from the
stingless bee Melipona orbignyi. International Jour-
nal of Molecular Science, 18(5), 953-971.
Sartori, G., Pesarico, A., Pinton, S., Dobrachinski, F.,
Roman, S., Pauletto, F., ... & Prigol, M. (2012).
Protective effect of brown Brazilian propolis aga-
inst acute vaginal lesions caused by herpes simplex
virus type 2 in mice: involvement of antioxidant and
anti-inflammatory mechanisms. Cell Biochemistry
and Function, 30(1), 1-10.
Sawaya, A., Souza, K., Marcucci, M., Cunha, I., & Shi-
mizu, M. (2004). Analysis of the composition of
Brazilian propolis extracts by chromatography and
evaluation of their in vitro activity against gram-
positive bacteria. Brazilian Journal Microbiology,
35(1-2), 104-109.
Serra, V.M.A. (2017). La Resistencia microbiana en el
context actual y la importancia del conocimiento
y aplicación en la política antimicrobiana. Revista
Habanera de Ciencias Médicas, 16(3), 402-419.
Sforcin, J., Fernandes, Jr. A., Lopes, C., Bankova, V., &
Funari, S. (2000). Seasonal effect on Brazilian pro-
polis antibacterial activity. Journal of Ethnopharma-
cology, 73(1-2), 243-249.
Shrestha, S., Narukawa, Y., & Takeda, T. (2007). Chemical
constituents of Nepalese propolis (II). Chemical and
Pharmaceutical Bulletin, 55(6), 926-929.
Silici, S., & Kutluca, S. (2005). Chemical composition and
antibacterial activity of propolis collected by three
different races of honeybees in the same region. Jour-
nal of Ethnopharmacology, 99(1), 69-73.
Soto, G., Moreno, L., & Pahua, D. (2016). Panorama
epidemiológico de México, principales causas de
morbilidad y mortalidad. Revista de la Facultad de
Medicina (México), 59(6), 8-22.
Sprin, J., & Bankova, V. (2011) Propolis: is there a poten-
tial for the development of new drugs? Journal of
Ethnopharmacoly, 133(2), 253-260.
Takaisi-Kikuni, N., & Schilcher, H. (1994). Electron
microscopic and microcalorimetric investigations of
the possible mechanism of the antibacterial action
of a defined propolis provenance. Planta Medica,
60(3), 222-227.
Tallarida, R.J. (2001). Drug synergism: its detection and
applications. Journal of Pharmacology and Experi-
mental Therapeutics, 298(3), 865-872.
Taroco, R., Seija, V., & Vignoli R. (2006). Métodos de
estudio de sensibilidad antibiótica. Sección I, Control
de poblaciones microbianas. Temas de Bacteriología
y Virología Médica. Montevideo, Uruguay: Universi-
dad de la República.
Trusheva, B., Todorov, I., Ninova, M., Najdenski, H.,
Daneshmand, A., & Bankova, V. (2010). Antibacte-
rial mono-and sesquiterpene esters of benzoic acids
from Iranian propolis. Chemistry Central Journal,
4(1), 8-12.
Tsao, S.M., & Yin, M.C. (2001). In-vitro antimicrobial
activity of four diallyl sulphides occurring naturally
35
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol.) • Vol. 69(1): 23-35, March 2021
in garlic and Chinese leek oils. Journal of Medical
Microbiology, 50(7), 646-649.
Ushimaru, P., Barbosa, L., Fernandez, A., Di Stasi, L., &
Júnior, A. (2012). In vitro antibacterial activity of
medicinal plant extracts against Escherichia coli stra-
ins from human clinical specimens and interactions
with antimicrobial drugs. Natural Product Research,
26(16), 1553-1557.
Uzel, A., Önçağ, Ö., Çoğulu, D., & Gençay, Ö. (2005).
Chemical compositions and antimicrobial activities
of four different Anatolian propolis samples. Micro-
biological Research, 160(2), 189-195.
Wang, K., Zhang, J., Ping, S., Ma, Q., Chen, X., Xuan,
H., … & Hu, F. (2014). Anti-inflammatory effects of
ethanol extracts of Chinese propolis and buds from
poplar (Populus × canadensis). Journal of Ethnophar-
macology, 155(1), 300-311.
