647
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
Cultivo in vitro de raíces pilosas del arbusto
Phyllanthus acuminatus (Phyllanthaceae)
Raquel Pérez Méndez*1; https://orcid.org/0000-0003-0656-263X
Karol Jiménez Quesada1; https://orcid.org/0000-0002-0162-9279
Giovanni Garro Monge1; https://orcid.org/0000-0001-7578-1938
1. Centro de Investigación en Biotecnología, Tecnológico de Costa Rica. Cartago, Costa Rica;
raquelpm1894@gmail.com (*Correspondencia), kjimenez@itcr.ac.cr, ggarro@itcr.ac.cr
Recibido 10-I-2022. Corregido 07-VII-2022. Aceptado 08-IX-2022.
ABSTRACT
In vitro culture of hairy roots of the shrub, Phyllanthus acuminatus (Phyllanthaceae)
Introduction: Under natural conditions, the roots of the shrub, Phyllanthus acuminatus, produce low concentra-
tions of secondary metabolites of medicinal interest. This opens an opportunity for in vitro culture, to increase
metabolite concentration.
Objective: To determine the optimal liquid culture conditions for hairy roots of P. acuminatus.
Methods: We used biomass growth evaluation according to initial inoculum percentage (0.50 and 0.10 %), per-
centage of medium nutrients (100, 50 and 25 %) and agitation rate (90, 100 and 110 min-1) (N=15 replications).
Results: The best liquid culture conditions were: 0.10 % of initial inoculum, nutrients at 25 % and 90 min-1 for
the agitation rate. There are differences among hairy roots and non-transformed roots.
Conclusions: It is feasible to produce P. acuminatus hairy roots at a large scale, applying and implementing the
evaluated conditions of inoculum percentage, nutrients in the medium and agitation rates.
Key words: agitation; inoculum; secondary metabolites; morphoanatomy; nutrients.
https://doi.org/10.15517/rev.biol.trop.2022.49227
OTRO
INTRODUCCIÓN
A través de los años, la obtención de
nuevos fármacos ha procurado mejorar los
problemas de salud. Especialmente, se han ana-
lizado extractos de distintas fuentes vegetales,
las cuales han mostrado ser recursos medici-
nales prometedores para obtener compuestos
naturales con la capacidad de tratar distintas
enfermedades (Navarro et al., 2017). Se estima
que, más del 60% de los fármacos que existen
en la actualidad, proceden de fuentes naturales
(Alvarado et al., 2013).
De manera natural, las concentraciones
de estos compuestos dentro de la planta son
bajas o fluctúan debido a variaciones geográ-
ficas, estacionales y ambientales (Murthy et
al., 2014). Esta situación hace que el uso de las
plantas en campo no sea económicamente via-
ble, ya que se tendría que recuperar las grandes
extensiones de tierra utilizadas para obtener
una cantidad adecuada del compuesto de inte-
rés (Pérez, 2008). Es entonces que, el cultivo de
órganos in vitro mediante ingeniería genética
evidencia una alternativa factible para producir
estos fitoquímicos (Tian, 2015).
648 Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
En este sentido, las plantas del género Phy-
llanthus destacan por su uso distinguido debido
a que cuentan con gran número de metabolitos
secundarios presentes en sus especies (Mao et
al., 2016). Algunas investigaciones han mos-
trado la presencia de diferentes metabolitos y
se ha encontrado que estos poseen actividad
antibacterial, antioxidante, antiviral, antidiabé-
tica, antidiarreica, entre otras (Mao et al., 2016;
Pettit, 2001; Rondón et al., 2015; Sekaran et al.,
2014; Von Keudell & van der Giessen, 2002).
En el caso de la especie P. acuminatus,
se le atribuye gran capacidad antitumoral,
anticáncer, antimalárica, antihepatotóxica y
antimicrobiana (de García et al., 1995; Navarro
et al., 2017; Sekaran et al., 2014). Además,
estudios fitoquímicos exponen el contenido
de lignanos, alcaloides, flavonoides, fenoles,
taninos y terpenoides en P. acuminatus, lo cual
representa una inmensa fuente de compuestos
terapéuticos e industriales (Abhyankar et al.,
2013; Makhzoum et al., 2013).
Recientemente, Alvarado et al. (2013)
explica que del Instituto Nacional contra el
Cáncer (NCI), descubrieron compuestos anti-
cancerígenos en la raíz de P. acuminatus, los
cuales son importantes debido a que pueden ser
utilizados para el tratamiento de enfermedades
como el cáncer de mama. Asimismo, estudios
realizados por el Laboratorio de Fitoquímica
de la Universidad Nacional de Costa Rica,
han logrado identificar cualitativamente, la
presencia de filantósidos, lignanos y otros
compuestos fenólicos en extractos de la raíz de
P. acuminatus.
Sin embargo, a pesar de la anterior litera-
tura, en lo que respecta al estudio del cultivo
de las raíces de P. acuminatus como fuente
de metabolitos secundarios, es escaso y limi-
tado (Bhattacharyya & Bhattacharyya, 2004;
Navarro et al., 2017), ya que hasta el momento
no se ha realizado investigación de produc-
ción de compuestos de interés para la especie
P. acuminatus.
Para lograr la producción de metabolitos
secundarios de interés medicinal, se han utili-
zado distintos sistemas biológicos como lo es el
cultivo in vitro de células y órganos (de la Cruz
& Gonzalez, 2017). El cultivo de raíces pilosas
ha ganado preferencia, ya que este cuenta con
la ventaja de ser genética y bioquímicamente
estable, tiene potencial enzimático similar a
la planta madre y los requerimientos de culti-
vo son relativamente baratos (Banerjee et al.,
2012). Las raíces pilosas consisten en órganos
que pueden crecer de manera aislada gracias a
la presencia de genes de la bacteria A. rhizo-
genes, los cuales son transmitidos mediante el
proceso de transformación genética (Matveeva
& Sokornova, 2016).
Entonces, es trascendental contar con un
protocolo que permita el óptimo desarrollo de
las raíces pilosas en un cultivo, donde se tomen
en cuenta los factores físicos y químicos que
influyen en el crecimiento y productividad
de estas, lo cual debe ser evaluado de mane-
ra experimental (Sevón & Oksman, 2002).
Algunos de estos factores de importancia son:
densidad del inóculo al iniciar el cultivo, tem-
peratura, composición del medio de cultivo,
velocidad de agitación, luz y fotoperiodo, entre
otros (Bhattacharyya & Bhattacharyya, 2004;
Garro et al., 2012). Por lo anterior, la opti-
mización de condiciones óptimas mediante
ingeniería genética y el escalamiento de los
cultivos de raíces pilosas son necesarios para
la más adecuada producción de biomasa y
metabolitos secundarios (Arias et al., 2009;
Ooi et al., 2013).
De esta forma, el objetivo de este estudio
fue determinar las condiciones óptimas del
cultivo líquido, de acuerdo con el porcentaje de
inóculo, porcentaje de sales en el medio de cul-
tivo y velocidad de agitación, necesarias para
el establecimiento de raíces pilosas de P. acu-
minatus a nivel de matraz, y también, evaluar el
desarrollo de las raíces pilosas en medio líqui-
do mediante el rendimiento del crecimiento de
biomasa y la caracterización morfoanatómica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal: El material vegetal
utilizado fue cultivos de raíces pilosas de
Phyllanthus acuminatus Vahl obtenidos del
proceso de transformación genética mediante
649
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
A. rhizogenes realizado y establecido en el
Centro de Investigación en Biotecnología del
Instituto Tecnológico de Costa Rica, Costa Rica
(Garro et al., 2018).
Optimización para el establecimiento de
raíces pilosas en medio líquido
Porcentaje de inóculo y de nutrientes en
el medio de cultivo: Para el ensayo de porcen-
taje de inóculo se probaron dos cantidades de
inóculos de 0.10 % y 0.5 %, correspondientes
a un peso de 25 mg y 125 mg respectivamente,
lo cual se basa en los estudios de Bhattacharyya
& Bhattacharya (2004) y Gai et al. (2015). El
medio de cultivo utilizado fue la mezcla de
sales M&S (Murashige & Skoog, 1962) al 100
% con 3 % de sacarosa a un pH de 5.7. En total
para cada porcentaje de inóculo (0.10 % y 0.50
%) se usaron 15 matraces de 125 ml (n = 15).
Para esta parte, se tomaron segmentos de
las raíces y se colocaron en papel filtro para
remover el exceso de medio de cultivo viejo.
Después, se pusieron las raíces en la balanza
hasta alcanzar los pesos mencionados. Las
raíces pilosas se mantuvieron durante cuatro
semanas en el medio líquido con una agitación
de 90 min-1, luz difusa, temperatura de 25 ± 2
°C, durante cuatro semanas (Bhattacharyya &
Bhattacharya, 2004; Garro et al., 2012).
Transcurrido el tiempo de cuatro semanas,
se siguió con la medición del peso fresco final
de las raíces en cada matraz (Bansal et al.,
2014). Para esto, se dejó secar el conjunto de
raíces de los matraces durante 5 min con el
flujo de aire de la cámara en papel filtro y luego
se determinó el peso.
Del anterior procedimiento, resultó que las
mejores condiciones fueron para el porcentaje
de inóculo de 0.10 % de raíces pilosas (25 mg).
Entonces, se utilizó este inóculo para proceder
a determinar el porcentaje de nutrientes. Para
esto, se probó el medio de cultivo de acuer-
do con el porcentaje de sales, para lo cual se
utilizó M&S al 100 %, 50 % y 25 % de sus
nutrientes con 3 % de sacarosa y un pH de
5.7 (Bhattacharyya & Bhattacharya, 2004). En
total para cada porcentaje de nutrientes (100 %,
50 % y 25 %) se usaron 15 matraces de 125 ml
(n = 15).
Luego del pesaje inicial de las raíces pilo-
sas y al ponerlas en el porcentaje de medio
correspondiente, se mantuvieron con una agi-
tación a 90 min-1, luz difusa y a una tempe-
ratura de 25 ± 2 °C, durante cuatro semanas.
Seguidamente, se determinó el peso final de
cada uno de los matraces, tal y como se des-
cribió anteriormente.
Velocidad de agitación: La definición del
porcentaje de inóculo inicial y de nutrientes
para el crecimiento de las raíces pilosas, fueron
0.10 % y 25 % respectivamente. Entonces,
empleando ambas condiciones, se pasó a defi-
nir la velocidad de agitación adecuada para
el cultivo líquido de las raíces pilosas. Las
velocidades de agitación utilizadas fueron: 90,
100 y 110 min-1, considerando los estudios de
Bhattacharyya & Bhattacharya (2004), Garro
et al. (2012), Pérez (2008) y Sabater (2013). En
total para cada velocidad de agitación (110, 100
y 90 min-1) se usaron 15 matraces para cada
valor de agitación (n = 15).
Al igual que los ensayos anteriores, para
la medición del peso fresco inicial se tomaron
segmentos de raíces y se colocaron en papel
filtro para remover el exceso de medio de cul-
tivo viejo. Después, se pusieron las raíces en
la balanza hasta alcanzar 25 mg de raíces para
cada uno de los matraces. Las condiciones de
crecimiento empleadas fueron: luz difusa, a
una temperatura de 25 ± 2 °C, durante cuatro
semanas. El peso fresco final se realizó igual-
mente que los ensayos anteriores.
Para calcular la cantidad de biomasa obte-
nida de las muestras de cada una de las pruebas
de optimización (porcentaje de inóculo, por-
centaje de nutrientes en el medio y velocidad
de agitación) se utilizó ecuación 1, basada en
el estudio de Urbanska et al. (2014):
(Ecuación 1).
Donde, %RB es el porcentaje de rendi-
miento de biomasa, pf es peso fresco final y
650 Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
pi es peso fresco inicial, del cúmulo de raíces
cada matraz.
Comparación de las condiciones ópti-
mas y condiciones estándar para las raíces
pilosas: Se realizó una comparación del creci-
miento basado en el porcentaje de rendimiento
de biomasa, de las raíces pilosas cultivadas en
medio de cultivo M&S al 100 %, agitación
90 min-1 e inóculo de 0.02% (5 mg) (Bhatta-
charyya & Bhattacharya, 2004; Garro et al.,
2012; Pérez, 2008; Sabater, 2013); y raíces
pilosas cultivadas bajo las condiciones seleccio-
nadas después de los ensayos de optimización.
En la preparación de las raíces pilosas de
ambas condiciones, se pesaron 25 mg para cada
matraz de las condiciones optimizadas y 5 mg
para cada matraz de las condiciones estándar,
tal y como se llevó a cabo en los ensayos de
optimización. En total, para cada uno de los
dos tratamientos se utilizó un n = 30, donde
cada unidad correspondió a un matraz de 125
ml. Las condiciones de cultivo para estos trata-
mientos fueron: luz difusa, temperatura de 25 ±
2 °C, durante cuatro semanas (Bhattacharyya &
Bhattacharya, 2004; Garro et al., 2012).
Transcurrido el tiempo de cuatro semanas,
se tomaron las raíces de cada matraz, dejando
secar el conjunto de raíces de los matraces
durante cinco minutos con el flujo laminar en
papel filtro y se pesaron (Bansal et al., 2014).
Asimismo, para calcular el porcentaje de rendi-
miento de biomasa obtenida de las muestras de
cada uno de los dos tratamientos (condiciones
optimizadas y condiciones estándar) se utilizó
nuevamente la ecuación 1.
Comparación morfoanatómica de raí-
ces pilosas versus raíces sin transformar in
vitro: El análisis de la morfoanatomía de las
raíces pilosas de P. acuminatus se llevó a cabo
mediante una comparación de raíces in vitro
no transformadas (normales) provenientes de
plántulas in vitro y raíces pilosas establecidas
del tratamiento de condiciones optimizadas.
Para la visualización de la morfología
se utilizó un estereoscopio con un aumento
de 40X. Se tomaron las raíces normales no
transformadas y las raíces pilosas del medio
líquido, y se lavaron con agua destilada para
eliminar el medio de cultivo. Luego, todas
las raíces fueron colocadas en papel filtro
para secarlas. Después, estas se observaron al
estereoscopio y se tomaron fotografías para
las comparaciones.
Adicionalmente, se realizó un análisis de
la morfoanatomía de las raíces in vitro no
transformadas y las raíces pilosas, a través de
un microscopio electrónico de barrido. Para
esto, las muestras de las raíces (sin transfor-
mar y transformadas) fueron colocadas en una
cinta de carbono con doble cara adhesiva para
observarlas en el equipo y realizar las microfo-
tografías de estas.
Análisis estadístico: Los datos del diseño
completamente aleatorizado de la optimiza-
ción fueron analizados teniendo en cuenta el
cumplimiento de supuestos estadísticos (nor-
malidad de residuos, igualdad de varianzas,
aleatorización y valores atípicos), se estable-
cieron las diferencias de medias y/o medianas
por una prueba de t-student de dos muestras
para el porcentaje de inóculo y una prueba de
Kruskal-Wallis para el porcentaje de nutrientes
y velocidad de agitación; con una significancia
P < 0.05. Para los datos de las pruebas de con-
diciones optimizadas vs. condiciones estándar,
se hizo uso de un ANDEVA para la compara-
ción de medias por el método de Tukey con una
significancia P < 0.05. Todos los análisis fue-
ron realizados a través del programa Minitab®
(Minitab, 2021).
RESULTADOS
Optimización para el establecimiento de
raíces pilosas en medio líquido
Porcentaje de inóculo y de nutrientes en
el medio de cultivo: El efecto del porcentaje
de inóculo sobre las raíces pilosas puede ser
observado en la Fig. 1A, donde se obtuvo un
rendimiento de biomasa mayor para el por-
centaje de inóculo de 0.10 % en comparación
con el de 0.50 % y estas diferencias fueron
651
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
significativas (P < 0.05). Por otro lado, el
efecto del porcentaje de nutrientes en el medio
de cultivo sobre el rendimiento de biomasa es
presentado en la Fig. 1B; el rendimiento de bio-
masa fue mayor para el porcentaje de 25 % de
nutrientes en comparación con los porcentajes
de 50 % y 100 % (P < 0.05), los cuales resultan
ser mucho menores.
Velocidad de agitación: A diferencia de
los tratamientos anteriores, los resultados del
rendimiento de biomasa según distintos valores
de agitación (90, 100, 110 min-1) no mostra-
ron diferencias significativas (P > 0.05) con
respecto a sus medias (Fig. 2). No obstante, se
puede observar que el rendimiento de biomasa
se encontró por encima de un 93 %.
Comparación de las condiciones ópti-
mas y condiciones estándar para las raíces
pilosas: En la Fig. 3A se muestra el crecimien-
to de las raíces pilosas en el tratamiento de con-
diciones optimizadas en las pruebas anteriores
(inóculo al 0.10 %, porcentaje nutrientes al 25
% y velocidad de agitación a 90 min-1), donde
se observa gran presencia de vellos radiculares,
sin callo evidente. Por su parte, la Fig. 3B pre-
senta el crecimiento de las raíces pilosas bajo el
tratamiento de condiciones reportadas en lite-
ratura (inóculo al 0.02 %, porcentaje nutrientes
al 100 % y velocidad de agitación a 90 min-1),
las cuales no exponen vellos radiculares, pero
sí varias formaciones de callo. Para ambas
figuras se puede notar que el crecimiento y
morfología es claramente diferente, donde el
Fig. 1. Porcentajes de rendimiento de biomasa de raíces pilosas de P. acuminatus en medio de cultivo líquido después de
cuatro semanas de crecimiento. A. variaciones del porcentaje de inóculo; B. variaciones del porcentaje de nutrientes. Medias/
medianas con letras diferentes, difieren significativamente. / Fig. 1. Percentages of P. acuminatus hairy root biomass yield
in liquid culture medium after four weeks of growth. A. variations of inoculum percentages; B. variations of nutrients
percentages. Means/medians with different letters differ significantly.
652 Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
análisis estadístico comprobó estas diferencias
con un P < 0.05.
Comparación morfoanatómica de raí-
ces pilosas versus raíces sin transformar in
vitro: Como se puede observar en la Fig. 4A,
las raíces pilosas bajo estereoscopio mues-
tran las siguientes características: presencia
de muchas vellosidades, poco callo presente y
un comportamiento de geotropismo alterado,
es decir, un crecimiento de raíces hacia todas
direcciones. Por otro lado, las raíces sin trans-
formar de la Fig. 4C, presentan una raíz prin-
cipal de la cual salen raíces secundarias, pero
con la característica del gravitropismo positivo
o bien, crecimiento de raíces hacia abajo. Ana-
tómicamente, se observa en las Fig. 4B y Fig.
4D, que los sistemas vasculares de ambos tipos
Fig. 2. Porcentajes de rendimiento de biomasa de raíces pilosas de P. acuminatus en medio de cultivo líquido después
de cuatro semanas de crecimiento para los tratamientos de velocidad de agitación. Medianas con letras distintas difieren
significativamente. / Fig. 2. Percentages of P. acuminatus hairy root biomass yield in liquid culture medium after four weeks
of growth for agitation rate treatments. Medians with different letters differ significantly.
Fig. 3. Tratamientos de condiciones optimizadas vs. condiciones reportadas de raíces pilosas de P. acuminatus en medio
de cultivo líquido después de cuatro semanas a simple vista (1X). A. raíces pilosas bajo condiciones optimizadas; B. raíces
pilosas bajo condiciones reportadas. / Fig. 3. Optimized conditions vs. standard conditions treatments of P. acuminatus hairy
roots in liquid culture medium after four weeks of growth. A. hairy roots from optimized conditions; B. hairy roots from
standard conditions.
653
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
de raíces son parecidos; sin embargo, existen
ciertas excepciones en sus células epidérmicas,
pues las raíces pilosas están colocadas de forma
más suelta (Fig. 4B), lo cual no sucede para las
raíces sin transformar (Fig. 4D).
DISCUSIÓN
Optimización para el establecimiento de
raíces pilosas en medio líquido
Porcentaje de inóculo y de nutrientes en
el medio de cultivo: Las diferencias del ren-
dimiento de la biomasa en las variaciones del
porcentaje de inóculo (Fig. 1A) son atribuidas
a que, con cantidades de inóculo altas, como
las que se presentan en el porcentaje de 0.50
% con menor crecimiento de las raíces, estas
entran en senescencia más rápido, manifes-
tando baja capacidad biosintética (Thakore et
al., 2017). Con respecto a lo anterior Huang
et al. (2004), indican que, con un porcentaje
de inóculo adecuado, se puede obtener una
distribución uniforme de las raíces y que su
comportamiento en matraz sea el más eficiente,
justo como sucedió en este estudio cuando se
probó el 0.10 % de inóculo. De acuerdo con los
rendimientos de biomasa obtenidos en la Fig.
Fig. 4. Comparación morfoanatómica de raíces de P. acuminatus bajo estereoscopio (40X arriba) y microscopio electrónico de
barrido (400X abajo). A.-B. raíces pilosas en medio líquido; C.-D. raíces in vitro sin transformar. / Fig. 4. Morphoanatomical
comparison of P. acuminatus roots under stereoscope (40X above) and under scanning electron microscope (400X below).
A.-B. hairy roots in liquid culture; C.-D. in vitro un-transformed roots.
654 Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
1B, Bhattacharyya & Bhattacharya (2004) y
Gai et al., (2015) explican que hay una relación
inversamente proporcional entre el tamaño de
las raíces y la cantidad de sales presentes, ya
que, a menor concentración de nutrientes en el
medio, hubo mayor peso de raíces pilosas en
el cultivo.
Velocidad de agitación: En las diferentes
velocidades utilizadas, se presentaron porcen-
tajes de rendimiento de biomasa por encima
de 93 % (Fig. 2), rendimiento favorable en este
tipo de tratamiento. En todas las condiciones de
velocidad de agitación empleadas en la etapa
de matraz probablemente se logra una mez-
cla adecuada del cultivo, lo que provoca una
mayor transferencia de nutrientes del medio
a los órganos y la difusión de burbujas para
la oxigenación (Baque et al., 2012; Murthy et
al., 2008; Murthy et al., 2014) y así un mejor
crecimiento. A pesar de lo anterior, se sugiere
que, al no haber encontrado diferencias signifi-
cativas entre los tratamientos, se podría realizar
ensayos por fuera del rango de 90-110 rpm.
Comparación de las condiciones ópti-
mas y condiciones estándar para las raíces
pilosas: Se puede observar en la Fig. 3A que
las raíces desarrolladas en las condiciones
optimizadas cuentan con gran cantidad de
vellosidades y proliferación de raíces prin-
cipales y secundarias, de color blanquecino
y poca formación de callo, a diferencia de
las condiciones estándar, las cuales presentan
mucha formación de callo y una morfología
muy inusual, mostrando solamente raíces prin-
cipales muy gruesas sin proliferación de vellos
radiculares, tal y como se muestra en la Fig.
3B. Este mismo comportamiento inusual fue
reportado en el estudio de Kai et al. (2012),
donde las raíces pilosas de Anisodus acutan-
gulus también tuvieron esas dos morfologías,
las cuales fueron cultivadas en medio M&S y
crecieron a una agitación de 100 min-1 y a una
temperatura de 25 °C.
Es importante mencionar que existe una
densidad mínima crítica de inóculo por debajo
de la cual el crecimiento organogénico puede
no tener tanto éxito en la formación y creci-
miento de raíces (Murthy et al., 2014). Enton-
ces, al haber usado un inóculo de apenas 0.02
% (5 mg) para las condiciones estándar, resultó
en morfologías anormales como se observa en
la Fig. 3B. Esta variabilidad morfológica en la
que el explante falla en el desarrollo de raíces
pilosas normales y en su lugar produce mucha
cantidad de callo, se debe a una alteración
relacionada con la posición del ADN-T en el
genoma de la planta, lo cual puede variar entre
especies e incluso entre clones de la misma
especie con la que se trabaje (Saravanakumar
et al., 2012), como sucedió en este caso, ya que
en las condiciones optimizadas (inóculo al 0.10
%, porcentaje nutrientes al 25 % y velocidad
de agitación a 90 min-1) el crecimiento fue
mejor y normal en comparación con las con-
diciones estándar.
Comparación morfoanatómica de raíces
pilosas versus raíces sin transformar in vitro:
La presencia de gran cantidad de vellosidades,
poca formación de callo y geotropismo alte-
rado de las raíces pilosas de la Fig. 4A, se ha
visto en estudios como el de Ooi et al. (2013),
los cuales utilizaron raíces pilosas de Solanum
mammosum que fueron cultivadas en medio
M&S, crecieron a una agitación de 60 min-1 y
a una temperatura de 25 °C; para estas raíces
se mostró crecimiento plagiotrópico con alto
grado de ramificaciones y abundancia de pelos
radiculares. Este crecimiento plagiotrópico se
debe probablemente a la ausencia de amilo-
plastos en los granos de almidón en las raíces
pilosas (Setamam et al., 2014); por tanto, llevan
al crecimiento de las raíces en distintas direc-
ciones como sucede en P. acuminatus.
En el caso de las raíces sin transformar, se
obtuvo de la Fig. 4C, la presencia de raíz prin-
cipal más raíces secundarias con gravitropismo
positivo, lo cual se presenta en raíces naturales
sin transformar (Setamam et al., 2014). Ade-
más, se observa la formación de callo en la raíz
principal, donde la raíz está en contacto con el
tallo de la plántula.
Anatómicamente, las diferencias encontra-
das en las células epidérmicas de los sistemas
655
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
vasculares de ambos tipos de raíces de las Fig.
4B y Fig. 4D, se debe a que, las células epidér-
micas de las raíces pilosas se encuentran situa-
das de forma suelta y presentan muchos pelos
radiculares (Fig. 4B); por otro lado, las raíces
sin transformar cuentan con un mayor empa-
camiento de las células epidérmicas con pocas
extensiones de raíz (Fig. 4D), tal y como expli-
can Makhzoum et al. (2013) en raíces de Eschs-
cholzia californica y Papaver somniferum.
Según lo discutido anteriormente, se con-
cluye que la producción de raíces pilosas de
P. acuminatus está influenciado significati-
vamente por factores como el porcentaje de
inóculo, porcentaje de nutrientes y velocidad
de agitación para el rendimiento de biomasa
de raíces pilosas a nivel de matraz. Acorde con
las condiciones probadas, la mayor cantidad de
biomasa se logró con una cantidad de inóculo
al 0.10 %, porcentaje de nutrientes en el medio
al 25 % y velocidad de agitación a 90 min-1.
Estas condiciones de producción in vitro resul-
tan en raíces pilosas con diferencias en morfo-
logía con respecto a las raíces sin transformar,
específicamente, por la presencia de prolifera-
ción de vellos radiculares y comportamiento
de gravitropismo negativo. Las condiciones
evaluadas en este estudio crean una opción para
la producción a mayor escala de la biomasa de
las raíces de P. acuminatus.
Declaración de ética: los autores declaran
que todos están de acuerdo con esta publica-
ción y que han hecho aportes que justifican
su autoría; que no hay conflicto de interés de
ningún tipo; y que han cumplido con todos los
requisitos y procedimientos éticos y legales
pertinentes. Todas las fuentes de financiamien-
to se detallan plena y claramente en la sección
de agradecimientos. El respectivo documento
legal firmado se encuentra en los archivos de
la revista.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Vicerrectoría
de Investigación y Extensión del Tecnológico
de Costa Rica por el aporte de los recursos
necesarios para la realización de este estu-
dio. También se agradece la colaboración del
Centro de Investigación en Biotecnología y
Laboratorio de Microscopía del Tecnológico de
Costa Rica.
RESUMEN
Introducción: En condiciones naturales, las raíces del
arbusto, Phyllanthus acuminatus, producen bajas concen-
traciones de metabolitos secundarios de interés medicinal.
Esto abre una oportunidad para el cultivo in vitro, para
aumentar la concentración de metabolitos.
Objetivo: Determinar las condiciones óptimas de cultivo
líquido para raíces pilosas de P. acuminatus.
Métodos: Se utilizó la evaluación del crecimiento de la
biomasa según porcentaje de inóculo inicial (0.50 y 0.10
%), porcentaje de nutrientes de los medios (100, 50 y
25 %) y tasa de agitación (90, 100 y 110 min-1) (N= 15
repeticiones).
Resultados: Las mejores condiciones de cultivo líquido
fueron: 0.10 % de inóculo inicial, nutrientes al 25 % y 90
min-1 para la tasa de agitación. Hay diferencias entre las
raíces pilosas y las raíces no transformadas.
Conclusiones: es factible producir raíces pilosas de P.
acuminatus a gran escala, aplicando e implementando las
condiciones evaluadas de porcentaje de inóculo, nutrientes
en el medio y tasas de agitación utilizadas en este estudio.
Palabras clave: agitación; inóculo; metabolitos secunda-
rios; morfoanatomía; nutrientes.
REFERENCIAS
Abhyankar, G., Rao, K., & Reddy, V. (2013). Genomic and
metabolomic fingerprinting of Phyllanthus amarus
(Schumm & Thonn) hairy root clones. Annals of
Phytomedicine, 2, 74–88.
Alvarado, D., Rodríguez, G., & Carballo, S. (2013). Eva-
luación de la composición química (Filantósidos
y Lignanos) de los extractos crudos del árbol de
Chilillo (Phyllantus acuminatus Vahl) procedente de
diferentes sitios de Costa Rica. Uniciencia, 27(1),
304–318.
Arias, M., Angarita, M., Aguirre, A., Restrepo, J., &
Montoya, C. (2009). Estrategias para incrementar la
producción de metabolitos secundarios en cultivos
de células vegetales. Revista Facultad Nacional de
Agronomía, Medellín, 62(1), 4881–4895.
Banerjee, S., Singh, S., & Rahman, L. (2012). Biotransfor-
mation studies using hairy root cultures—a review.
Biotechnology Advances, 30(3), 461–468. https://doi.
org/10.1016/j.biotechadv.2011.08.010
656 Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
Bansal, M., Kumar, A., & Reddy, M. (2014). Influence
of Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root
induction and ‘bacoside A’production from Baco-
pa monnieri (L.) Wettst. Acta Physiologiae Plan-
tarum, 36(10), 2793–2801. https://doi.org/10.1007/
s11738-014-1650-5
Baque, M., Moh, S., Lee, E., Zhong, J., & Paek, K.
(2012). Production of biomass and useful com-
pounds from adventitious roots of high value added
medicinal plants in bioreactor. Biotechnology Advan-
ces, 30(6), 1255–1267. https://doi.org/10.1016/j.
biotechadv.2011.11.004
Bhattacharyya, R., & Bhattacharya, S. (2004). Develop-
ment of a potent in vitro source of Phyllanthus ama-
rus roots with pronounced activity against surface
antigen of the hepatitis B virus. In Vitro Cellular
and Developmental Biology-Plant, 40(5), 504–508.
https://doi.org/10.1079/IVP2004560
de la Cruz, I., & Gonzalez, A. (2017). Biotecnología apli-
cada a la producción de metabolitos secundarios.
Lacandonia, 3(2), 59–66.
de García, C., Sanchez, Y., & Gómez, E. (1995). Activi-
dad antimicrobiana de Phyllanthus acuminatus Vahl.
Revista Colombiana de Ciencias Químico-Farmaceú-
ticas, 24(1), 35–39.
Gai, Q., Jiao, J., Luo, M., Wang, W., Ma, W., Zu, Y., & Fu,
Y. (2015). Establishment of high-productive Isatis
tinctoria L. hairy root cultures: a promising approach
for efficient production of bioactive alkaloids. Bio-
chemical Engineering Journal, 95, 37–47. https://doi.
org/10.1016/j.bej.2014.12.006
Garro, G., Jiménez, K., & Pérez, R. (2018). Desarrollo
de un sistema de cultivo in vitro de raíces pilosas
de Phyllantus acumminatus, para la producción de
compuestos con actividad biológica. Tecnología en
Marcha, 31(3), 66–73. http://dx.doi.org/10.18845/
tm.v31i3.3903
Garro, G., Ramijan, K., Blanco, B., Lam, K., & Alvarenga,
S. (2012). Implementación de un protocolo para la
producción de raíces pilosas (hairy roots) de uña de
gato (Uncaria tomentosa) mediante transformación
con Agrobacterium rhizogenes. Tecnología en Mar-
cha, 25(3), 28–38.
Huang, S., Hung, C., & Chou, S. (2004). Innovative
strategies for operation of mist trickling reactors
for enhanced hairy root proliferation and secon-
dary metabolite productivity. Enzyme and Microbial
Technology, 35(1), 22–32. https://doi.org/10.1016/j.
enzmictec.2004.03.011
Kai, G., Zhang, A., Guo, Y., Li, L., Cui, L., Luo, X., Liu,
C., & Xiao, J. (2012). Enhancing the production of
tropane alkaloids in transgenic Anisodus acutangu-
lus hairy root cultures by over-expressing tropino-
ne reductase I and hyoscyamine-6β-hydroxylase.
Molecular BioSystems, 8(11), 2883–2890. https://doi.
org/10.1039/C2MB25208B
Makhzoum, A., Sharma, P., Bernards, M., & Trémouillaux,
J. (2013). Hairy roots: an ideal platform for trans-
genic plant production and other promising appli-
cations. In D. R. Gang (Ed.), Phytochemicals, Plant
Growth, and the Environment (pp. 95–142). Springer.
https://doi.org/10.1007/978-1-4614-4066-6_6
Mao, X., Wu, L., Guo, H., Chen, W., Cui, Y., Qi, Q., Li, S.,
Liang, W., Yang, G., Shao, Y., Zhu, D., She, G., You,
Y., & Zhang, L. (2016). The genus Phyllanthus: an
ethnopharmacological, phytochemical, and pharma-
cological review. Evidence-Based Complementary
and Alternative Medicine, 2016, 7584952. https://doi.
org/10.1155/2016/7584952
Matveeva, T., & Sokornova, S. (2016). Agrobacterium
rhizogenes-mediated transformation of plants for
improvement of yields of secondary metabolites. In
A. Pavlov, & T. Bley (Eds.), Bioprocessing of Plant
In Vitro Systems (pp. 1–42). Springer. https://doi.
org/10.1007/978-3-319-32004-5_18-1
Minitab, LLC. (2021). Minitab (Software). https://www.
minitab.com
Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for
rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultu-
res. Physiologia Plantarum, 15(3), 473–497.
Murthy, H., Hahn, E., & Paek, K. (2008) Adventitious root
and secondary metabolism. Chinese Journal of Bio-
technology, 24(5), 711–716. https://doi.org/10.1016/
S1872-2075(08)60035-7
Murthy, H., Lee, E., & Paek, K. (2014). Production of
secondary metabolites from cell and organ cultures:
strategies and approaches for biomass improvement
and metabolite accumulation. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture, 118(1), 1–16. https://doi.org/10.1007/
s11240-014-0467-7
Navarro, M., Moreira, I., Arnaez, E., Quesada, S., Azofeifa,
G., Vargas, F., Alvarado, D., & Chen, P. (2017). Flavo-
noids and ellagitannins characterization, antioxidant
and cytotoxic activities of Phyllanthus acumina-
tus Vahl. Plants, 6(4), 62. https://doi.org/10.3390/
plants6040062
Ooi, C., Syahida, A., Stanslas, J., & Maziah, M. (2013).
Efficiency of different Agrobacterium rhizogenes
strains on hairy roots induction in Solanum mam-
mosum. World Journal of Microbiology and Biote-
chnology, 29(3), 421–430. https://doi.org/10.1007/
s11274-012-1194-z
Pérez, M. (2008). Evaluación de la producción de meta-
bolitos anticancerígenos a partir de células en
suspensión de Caléndula officinalis (Tesis docto-
ral). Universidad Nacional de Colombia, Medellín,
Colombia.
657
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
Pettit, G. (2001). Evolutionary Biosynthesis of Anticancer
Drugs. In I. Ojima, G. Vite, & K. H. Altmann (Eds.),
Anticancer Agents (pp. 16–42). ACS Symposium
Series. https://doi.org/10.1021/bk-2001-0796.ch002
Rondón, M., García, I., Cornejo, X., Rojas, J., & Terán,
W. (2015). Phytochemical screening and antioxidant
activity of seven medicinal plants species from Ecua-
dor. Pharmacology Online, 3, 19–28.
Sabater, A. (2013). Estudio de las respuestas de defensa
inducidas por elicitores en cultivos de células vegeta-
les (Tesis Doctoral). Universidad de Murcia, España.
Saravanakumar, A., Aslam, A., & Shajahan, A. (2012).
Development and optimization of hairy root culture
systems in Withania somnifera (L.) Dunal for witha-
ferin-A production. African Journal of Biotechno-
logy, 11(98), 16412–16420. https://doi.org/10.5897/
AJB11.3867
Sekaran, S., Tang, Y., & Lee, S. (2014). Phyllanthus sp.
a local plant with multiple medicinal properties.
Journal of Health and Translational Medicine, 17(2),
35–42.
Setamam, N., Sidik, N., Rahman, Z., & Zain, C. (2014).
Induction of hairy roots by various strains of Agro-
bacterium rhizogenes in different types of Capsicum
species explants. BMC Research Notes, 7(1), 1–8.
https://doi.org/10.1186/1756-0500-7-414
Sevón, N., & Oksman, K. (2002). Agrobacterium rhizo-
genes-mediated transformation: root cultures as a
source of alkaloids. Planta Medica, 68(10), 859–868.
https://doi.org/10.1055/s-2002-34924
Thakore, D., Srivastava, A., & Sinha, A. (2017). Mass
production of Ajmalicine by bioreactor cultivation
of hairy roots of Catharanthus roseus. Biochemi-
cal Engineering Journal, 119, 84–91. https://doi.
org/10.1016/j.bej.2016.12.010
Tian, L. (2015). Using hairy roots for production of
valuable plant secondary metabolites. In R. Krull, &
T. Bley (Eds.), Filaments in Bioprocesses (pp. 275–
324). Springer. https://doi.org/10.1007/10_2014_298
Urbanska, N., Giebultowicz, J., Olszowska, O., & Szypula,
W. (2014). The growth and saponin production of
Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC. (Chinese
bellflower) hairy roots cultures maintained in shake
flasks and mist bioreactor. Acta Societatis Botanico-
rum Poloniae, 83(3), 1–10. https://doi.org/10.5586/
asbp.2014.017
Von Keudell, C., & van der Giessen, R. (2002). U.S. Patent
Application No. 09/884,461.
