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Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 70: 647-657, e49227, enero-diciembre 2022 (Publicado Set. 15, 2022)
Cultivo in vitro de raíces pilosas del arbusto
Phyllanthus acuminatus (Phyllanthaceae)
Raquel Pérez Méndez*1; https://orcid.org/0000-0003-0656-263X
Karol Jiménez Quesada1; https://orcid.org/0000-0002-0162-9279
Giovanni Garro Monge1; https://orcid.org/0000-0001-7578-1938
1. Centro de Investigación en Biotecnología, Tecnológico de Costa Rica. Cartago, Costa Rica;
raquelpm1894@gmail.com (*Correspondencia), kjimenez@itcr.ac.cr, ggarro@itcr.ac.cr
Recibido 10-I-2022. Corregido 07-VII-2022. Aceptado 08-IX-2022.
ABSTRACT
In vitro culture of hairy roots of the shrub, Phyllanthus acuminatus (Phyllanthaceae)
Introduction: Under natural conditions, the roots of the shrub, Phyllanthus acuminatus, produce low concentra-
tions of secondary metabolites of medicinal interest. This opens an opportunity for in vitro culture, to increase
metabolite concentration.
Objective: To determine the optimal liquid culture conditions for hairy roots of P. acuminatus.
Methods: We used biomass growth evaluation according to initial inoculum percentage (0.50 and 0.10 %), per-
centage of medium nutrients (100, 50 and 25 %) and agitation rate (90, 100 and 110 min-1) (N=15 replications).
Results: The best liquid culture conditions were: 0.10 % of initial inoculum, nutrients at 25 % and 90 min-1 for
the agitation rate. There are differences among hairy roots and non-transformed roots.
Conclusions: It is feasible to produce P. acuminatus hairy roots at a large scale, applying and implementing the
evaluated conditions of inoculum percentage, nutrients in the medium and agitation rates.
Key words: agitation; inoculum; secondary metabolites; morphoanatomy; nutrients.
https://doi.org/10.15517/rev.biol.trop.2022.49227
OTRO
INTRODUCCIÓN
A través de los años, la obtención de
nuevos fármacos ha procurado mejorar los
problemas de salud. Especialmente, se han ana-
lizado extractos de distintas fuentes vegetales,
las cuales han mostrado ser recursos medici-
nales prometedores para obtener compuestos
naturales con la capacidad de tratar distintas
enfermedades (Navarro et al., 2017). Se estima
que, más del 60% de los fármacos que existen
en la actualidad, proceden de fuentes naturales
(Alvarado et al., 2013).
De manera natural, las concentraciones
de estos compuestos dentro de la planta son
bajas o fluctúan debido a variaciones geográ-
ficas, estacionales y ambientales (Murthy et
al., 2014). Esta situación hace que el uso de las
plantas en campo no sea económicamente via-
ble, ya que se tendría que recuperar las grandes
extensiones de tierra utilizadas para obtener
una cantidad adecuada del compuesto de inte-
rés (Pérez, 2008). Es entonces que, el cultivo de
órganos in vitro mediante ingeniería genética
evidencia una alternativa factible para producir
estos fitoquímicos (Tian, 2015).
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En este sentido, las plantas del género Phy-
llanthus destacan por su uso distinguido debido
a que cuentan con gran número de metabolitos
secundarios presentes en sus especies (Mao et
al., 2016). Algunas investigaciones han mos-
trado la presencia de diferentes metabolitos y
se ha encontrado que estos poseen actividad
antibacterial, antioxidante, antiviral, antidiabé-
tica, antidiarreica, entre otras (Mao et al., 2016;
Pettit, 2001; Rondón et al., 2015; Sekaran et al.,
2014; Von Keudell & van der Giessen, 2002).
En el caso de la especie P. acuminatus,
se le atribuye gran capacidad antitumoral,
anticáncer, antimalárica, antihepatotóxica y
antimicrobiana (de García et al., 1995; Navarro
et al., 2017; Sekaran et al., 2014). Además,
estudios fitoquímicos exponen el contenido
de lignanos, alcaloides, flavonoides, fenoles,
taninos y terpenoides en P. acuminatus, lo cual
representa una inmensa fuente de compuestos
terapéuticos e industriales (Abhyankar et al.,
2013; Makhzoum et al., 2013).
Recientemente, Alvarado et al. (2013)
explica que del Instituto Nacional contra el
Cáncer (NCI), descubrieron compuestos anti-
cancerígenos en la raíz de P. acuminatus, los
cuales son importantes debido a que pueden ser
utilizados para el tratamiento de enfermedades
como el cáncer de mama. Asimismo, estudios
realizados por el Laboratorio de Fitoquímica
de la Universidad Nacional de Costa Rica,
han logrado identificar cualitativamente, la
presencia de filantósidos, lignanos y otros
compuestos fenólicos en extractos de la raíz de
P. acuminatus.
Sin embargo, a pesar de la anterior litera-
tura, en lo que respecta al estudio del cultivo
de las raíces de P. acuminatus como fuente
de metabolitos secundarios, es escaso y limi-
tado (Bhattacharyya & Bhattacharyya, 2004;
Navarro et al., 2017), ya que hasta el momento
no se ha realizado investigación de produc-
ción de compuestos de interés para la especie
P. acuminatus.
Para lograr la producción de metabolitos
secundarios de interés medicinal, se han utili-
zado distintos sistemas biológicos como lo es el
cultivo in vitro de células y órganos (de la Cruz
& Gonzalez, 2017). El cultivo de raíces pilosas
ha ganado preferencia, ya que este cuenta con
la ventaja de ser genética y bioquímicamente
estable, tiene potencial enzimático similar a
la planta madre y los requerimientos de culti-
vo son relativamente baratos (Banerjee et al.,
2012). Las raíces pilosas consisten en órganos
que pueden crecer de manera aislada gracias a
la presencia de genes de la bacteria A. rhizo-
genes, los cuales son transmitidos mediante el
proceso de transformación genética (Matveeva
& Sokornova, 2016).
Entonces, es trascendental contar con un
protocolo que permita el óptimo desarrollo de
las raíces pilosas en un cultivo, donde se tomen
en cuenta los factores físicos y químicos que
influyen en el crecimiento y productividad
de estas, lo cual debe ser evaluado de mane-
ra experimental (Sevón & Oksman, 2002).
Algunos de estos factores de importancia son:
densidad del inóculo al iniciar el cultivo, tem-
peratura, composición del medio de cultivo,
velocidad de agitación, luz y fotoperiodo, entre
otros (Bhattacharyya & Bhattacharyya, 2004;
Garro et al., 2012). Por lo anterior, la opti-
mización de condiciones óptimas mediante
ingeniería genética y el escalamiento de los
cultivos de raíces pilosas son necesarios para
la más adecuada producción de biomasa y
metabolitos secundarios (Arias et al., 2009;
Ooi et al., 2013).
De esta forma, el objetivo de este estudio
fue determinar las condiciones óptimas del
cultivo líquido, de acuerdo con el porcentaje de
inóculo, porcentaje de sales en el medio de cul-
tivo y velocidad de agitación, necesarias para
el establecimiento de raíces pilosas de P. acu-
minatus a nivel de matraz, y también, evaluar el
desarrollo de las raíces pilosas en medio líqui-
do mediante el rendimiento del crecimiento de
biomasa y la caracterización morfoanatómica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal: El material vegetal
utilizado fue cultivos de raíces pilosas de
Phyllanthus acuminatus Vahl obtenidos del
proceso de transformación genética mediante
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A. rhizogenes realizado y establecido en el
Centro de Investigación en Biotecnología del
Instituto Tecnológico de Costa Rica, Costa Rica
(Garro et al., 2018).
Optimización para el establecimiento de
raíces pilosas en medio líquido
Porcentaje de inóculo y de nutrientes en
el medio de cultivo: Para el ensayo de porcen-
taje de inóculo se probaron dos cantidades de
inóculos de 0.10 % y 0.5 %, correspondientes
a un peso de 25 mg y 125 mg respectivamente,
lo cual se basa en los estudios de Bhattacharyya
& Bhattacharya (2004) y Gai et al. (2015). El
medio de cultivo utilizado fue la mezcla de
sales M&S (Murashige & Skoog, 1962) al 100
% con 3 % de sacarosa a un pH de 5.7. En total
para cada porcentaje de inóculo (0.10 % y 0.50
%) se usaron 15 matraces de 125 ml (n = 15).
Para esta parte, se tomaron segmentos de
las raíces y se colocaron en papel filtro para
remover el exceso de medio de cultivo viejo.
Después, se pusieron las raíces en la balanza
hasta alcanzar los pesos mencionados. Las
raíces pilosas se mantuvieron durante cuatro
semanas en el medio líquido con una agitación
de 90 min-1, luz difusa, temperatura de 25 ± 2
°C, durante cuatro semanas (Bhattacharyya &
Bhattacharya, 2004; Garro et al., 2012).
Transcurrido el tiempo de cuatro semanas,
se siguió con la medición del peso fresco final
de las raíces en cada matraz (Bansal et al.,
2014). Para esto, se dejó secar el conjunto de
raíces de los matraces durante 5 min con el
flujo de aire de la cámara en papel filtro y luego
se determinó el peso.
Del anterior procedimiento, resultó que las
mejores condiciones fueron para el porcentaje
de inóculo de 0.10 % de raíces pilosas (25 mg).
Entonces, se utilizó este inóculo para proceder
a determinar el porcentaje de nutrientes. Para
esto, se probó el medio de cultivo de acuer-
do con el porcentaje de sales, para lo cual se
utilizó M&S al 100 %, 50 % y 25 % de sus
nutrientes con 3 % de sacarosa y un pH de
5.7 (Bhattacharyya & Bhattacharya, 2004). En
total para cada porcentaje de nutrientes (100 %,
50 % y 25 %) se usaron 15 matraces de 125 ml
(n = 15).
Luego del pesaje inicial de las raíces pilo-
sas y al ponerlas en el porcentaje de medio
correspondiente, se mantuvieron con una agi-
tación a 90 min-1, luz difusa y a una tempe-
ratura de 25 ± 2 °C, durante cuatro semanas.
Seguidamente, se determinó el peso final de
cada uno de los matraces, tal y como se des-
cribió anteriormente.
Velocidad de agitación: La definición del
porcentaje de inóculo inicial y de nutrientes
para el crecimiento de las raíces pilosas, fueron
0.10 % y 25 % respectivamente. Entonces,
empleando ambas condiciones, se pasó a defi-
nir la velocidad de agitación adecuada para
el cultivo líquido de las raíces pilosas. Las
velocidades de agitación utilizadas fueron: 90,
100 y 110 min-1, considerando los estudios de
Bhattacharyya & Bhattacharya (2004), Garro
et al. (2012), Pérez (2008) y Sabater (2013). En
total para cada velocidad de agitación (110, 100
y 90 min-1) se usaron 15 matraces para cada
valor de agitación (n = 15).
Al igual que los ensayos anteriores, para
la medición del peso fresco inicial se tomaron
segmentos de raíces y se colocaron en papel
filtro para remover el exceso de medio de cul-
tivo viejo. Después, se pusieron las raíces en
la balanza hasta alcanzar 25 mg de raíces para
cada uno de los matraces. Las condiciones de
crecimiento empleadas fueron: luz difusa, a
una temperatura de 25 ± 2 °C, durante cuatro
semanas. El peso fresco final se realizó igual-
mente que los ensayos anteriores.
Para calcular la cantidad de biomasa obte-
nida de las muestras de cada una de las pruebas
de optimización (porcentaje de inóculo, por-
centaje de nutrientes en el medio y velocidad
de agitación) se utilizó ecuación 1, basada en
el estudio de Urbanska et al. (2014):
(Ecuación 1).
Donde, %RB es el porcentaje de rendi-
miento de biomasa, pf es peso fresco final y
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pi es peso fresco inicial, del cúmulo de raíces
cada matraz.
Comparación de las condiciones ópti-
mas y condiciones estándar para las raíces
pilosas: Se realizó una comparación del creci-
miento basado en el porcentaje de rendimiento
de biomasa, de las raíces pilosas cultivadas en
medio de cultivo M&S al 100 %, agitación
90 min-1 e inóculo de 0.02% (5 mg) (Bhatta-
charyya & Bhattacharya, 2004; Garro et al.,
2012; Pérez, 2008; Sabater, 2013); y raíces
pilosas cultivadas bajo las condiciones seleccio-
nadas después de los ensayos de optimización.
En la preparación de las raíces pilosas de
ambas condiciones, se pesaron 25 mg para cada
matraz de las condiciones optimizadas y 5 mg
para cada matraz de las condiciones estándar,
tal y como se llevó a cabo en los ensayos de
optimización. En total, para cada uno de los
dos tratamientos se utilizó un n = 30, donde
cada unidad correspondió a un matraz de 125
ml. Las condiciones de cultivo para estos trata-
mientos fueron: luz difusa, temperatura de 25 ±
2 °C, durante cuatro semanas (Bhattacharyya &
Bhattacharya, 2004; Garro et al., 2012).
Transcurrido el tiempo de cuatro semanas,
se tomaron las raíces de cada matraz, dejando
secar el conjunto de raíces de los matraces
durante cinco minutos con el flujo laminar en
papel filtro y se pesaron (Bansal et al., 2014).
Asimismo, para calcular el porcentaje de rendi-
miento de biomasa obtenida de las muestras de
cada uno de los dos tratamientos (condiciones
optimizadas y condiciones estándar) se utilizó
nuevamente la ecuación 1.
Comparación morfoanatómica de raí-
ces pilosas versus raíces sin transformar in
vitro: El análisis de la morfoanatomía de las
raíces pilosas de P. acuminatus se llevó a cabo
mediante una comparación de raíces in vitro
no transformadas (normales) provenientes de
plántulas in vitro y raíces pilosas establecidas
del tratamiento de condiciones optimizadas.
Para la visualización de la morfología
se utilizó un estereoscopio con un aumento
de 40X. Se tomaron las raíces normales no
transformadas y las raíces pilosas del medio
líquido, y se lavaron con agua destilada para
eliminar el medio de cultivo. Luego, todas
las raíces fueron colocadas en papel filtro
para secarlas. Después, estas se observaron al
estereoscopio y se tomaron fotografías para
las comparaciones.
Adicionalmente, se realizó un análisis de
la morfoanatomía de las raíces in vitro no
transformadas y las raíces pilosas, a través de
un microscopio electrónico de barrido. Para
esto, las muestras de las raíces (sin transfor-
mar y transformadas) fueron colocadas en una
cinta de carbono con doble cara adhesiva para
observarlas en el equipo y realizar las microfo-
tografías de estas.
Análisis estadístico: Los datos del diseño
completamente aleatorizado de la optimiza-
ción fueron analizados teniendo en cuenta el
cumplimiento de supuestos estadísticos (nor-
malidad de residuos, igualdad de varianzas,
aleatorización y valores atípicos), se estable-
cieron las diferencias de medias y/o medianas
por una prueba de t-student de dos muestras
para el porcentaje de inóculo y una prueba de
Kruskal-Wallis para el porcentaje de nutrientes
y velocidad de agitación; con una significancia
P < 0.05. Para los datos de las pruebas de con-
diciones optimizadas vs. condiciones estándar,
se hizo uso de un ANDEVA para la compara-
ción de medias por el método de Tukey con una
significancia P < 0.05. Todos los análisis fue-
ron realizados a través del programa Minitab®
(Minitab, 2021).
RESULTADOS
Optimización para el establecimiento de
raíces pilosas en medio líquido
Porcentaje de inóculo y de nutrientes en
el medio de cultivo: El efecto del porcentaje
de inóculo sobre las raíces pilosas puede ser
observado en la Fig. 1A, donde se obtuvo un
rendimiento de biomasa mayor para el por-
centaje de inóculo de 0.10 % en comparación
con el de 0.50 % y estas diferencias fueron
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significativas (P < 0.05). Por otro lado, el
efecto del porcentaje de nutrientes en el medio
de cultivo sobre el rendimiento de biomasa es
presentado en la Fig. 1B; el rendimiento de bio-
masa fue mayor para el porcentaje de 25 % de
nutrientes en comparación con los porcentajes
de 50 % y 100 % (P < 0.05), los cuales resultan
ser mucho menores.
Velocidad de agitación: A diferencia de
los tratamientos anteriores, los resultados del
rendimiento de biomasa según distintos valores
de agitación (90, 100, 110 min-1) no mostra-
ron diferencias significativas (P > 0.05) con
respecto a sus medias (Fig. 2). No obstante, se
puede observar que el rendimiento de biomasa
se encontró por encima de un 93 %.
Comparación de las condiciones ópti-
mas y condiciones estándar para las raíces
pilosas: En la Fig. 3A se muestra el crecimien-
to de las raíces pilosas en el tratamiento de con-
diciones optimizadas en las pruebas anteriores
(inóculo al 0.10 %, porcentaje nutrientes al 25
% y velocidad de agitación a 90 min-1), donde
se observa gran presencia de vellos radiculares,
sin callo evidente. Por su parte, la Fig. 3B pre-
senta el crecimiento de las raíces pilosas bajo el
tratamiento de condiciones reportadas en lite-
ratura (inóculo al 0.02 %, porcentaje nutrientes
al 100 % y velocidad de agitación a 90 min-1),
las cuales no exponen vellos radiculares, pero
sí varias formaciones de callo. Para ambas
figuras se puede notar que el crecimiento y
morfología es claramente diferente, donde el
Fig. 1. Porcentajes de rendimiento de biomasa de raíces pilosas de P. acuminatus en medio de cultivo líquido después de
cuatro semanas de crecimiento. A. variaciones del porcentaje de inóculo; B. variaciones del porcentaje de nutrientes. Medias/
medianas con letras diferentes, difieren significativamente. / Fig. 1. Percentages of P. acuminatus hairy root biomass yield
in liquid culture medium after four weeks of growth. A. variations of inoculum percentages; B. variations of nutrients
percentages. Means/medians with different letters differ significantly.
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análisis estadístico comprobó estas diferencias
con un P < 0.05.
Comparación morfoanatómica de raí-
ces pilosas versus raíces sin transformar in
vitro: Como se puede observar en la Fig. 4A,
las raíces pilosas bajo estereoscopio mues-
tran las siguientes características: presencia
de muchas vellosidades, poco callo presente y
un comportamiento de geotropismo alterado,
es decir, un crecimiento de raíces hacia todas
direcciones. Por otro lado, las raíces sin trans-
formar de la Fig. 4C, presentan una raíz prin-
cipal de la cual salen raíces secundarias, pero
con la característica del gravitropismo positivo
o bien, crecimiento de raíces hacia abajo. Ana-
tómicamente, se observa en las Fig. 4B y Fig.
4D, que los sistemas vasculares de ambos tipos
Fig. 2. Porcentajes de rendimiento de biomasa de raíces pilosas de P. acuminatus en medio de cultivo líquido después
de cuatro semanas de crecimiento para los tratamientos de velocidad de agitación. Medianas con letras distintas difieren
significativamente. / Fig. 2. Percentages of P. acuminatus hairy root biomass yield in liquid culture medium after four weeks
of growth for agitation rate treatments. Medians with different letters differ significantly.
Fig. 3. Tratamientos de condiciones optimizadas vs. condiciones reportadas de raíces pilosas de P. acuminatus en medio
de cultivo líquido después de cuatro semanas a simple vista (1X). A. raíces pilosas bajo condiciones optimizadas; B. raíces
pilosas bajo condiciones reportadas. / Fig. 3. Optimized conditions vs. standard conditions treatments of P. acuminatus hairy
roots in liquid culture medium after four weeks of growth. A. hairy roots from optimized conditions; B. hairy roots from
standard conditions.