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Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
& Swinnen, 2016; Wickramasuriya & Dunwell,
2018). Atendiendo a estas razones, en este tra-
bajo de investigación se realiza una descripción
pormenorizada de los mecanismos ontogenéti-
cos de la formación de los granos de polen de
T. cacao, haciendo énfasis en la arquitectura
y morfología de las células arquesporiales,
células madre de las microsporas, formación y
estructura de la pared de las anteras, descrip-
ción del patrón de microsporogénesis, forma-
ción de la esporodermis, estructura y función
del tapete, micromorfología y ultraestructura
de los granos de polen.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se tomaron más de 30 flores por cada
etapa del desarrollo floral empleando el geno-
tipo CCN 51 (Colección Castro-Naranjal) por
ser ampliamente cultivado. Las muestras fue-
ron obtenidas del banco de germoplasma ex
situ del Centro de Investigaciones La Suiza
de la Corporación Colombiana de Investiga-
ción Agropecuaria (Agrosavia) ubicado en el
Municipio de Rionegro, Santander-Colombia
a 540 m de altitud (7°22’12” N & 73°11’39”
W) durante los meses de junio-julio del 2021.
Las flores se fijaron en una mezcla de formol,
etanol y ácido acético (FAA) por 24-48 horas a
6 °C. Posteriormente, se deshidrataron en una
serie gradual de etanol y dos pasos de aclara-
miento en Xilol (Ruzin, 1999) y se incluye-
ron en Paraplast plus (McCormick®) durante
12 horas a 55 °C. Se obtuvieron secciones
transversales y longitudinales con micrótomo
rotatorio LEICA RM® 2125, entre 4-5 μm de
grosor. Se procedió a la tinción de las muestras
con Safranina-azul de Alcian para distinguir
estructuras con paredes primarias y secundarias
y de manera no específica presencia de poli-
fenoles totales. Adicionalmente, muestras de
las flores con anteras maduras también fueron
teñidas con la técnica de PAS (ácido peryó-
dico de Schiff-Amidoblack) para discriminar
entre polisacáridos estructurales y de reserva,
además de la presencia de proteínas. Se utili-
zó Lacmoid para teñir calosa y determinar el
patrón de microsporogénesis. Para todas las
tinciones se procedió de acuerdo a literatura
especializada (Demarco, 2017; Ramming et
al., 1973; Rincón-Barón et al., 2020; Rincón-
Barón et al., 2021a; Ruzin, 1999; Soukup,
2014). Muestras adicionales en los diferentes
momentos del desarrollo floral fueron fijadas
en Glutaraldehído al 2.5 % en buffer fosfato
0.2 M pH 7.2 durante 24-48 horas a 6 °C.
Luego de la fijación, las muestras se lavaron en
el mismo buffer seguido de agua destilada para
posteriormente postfijarlas con Tetróxido de
Osmio al 2 % por 2 horas a 6 °C en oscuridad
y agitación constante. Finalmente, las muestras
se deshidrataron durante una hora en una serie
gradual de etanol y durante 12 horas etanol al
100 %. Las muestras se embebieron en mezclas
progresivas de óxido de propileno-resina Spurr,
por una semana a temperatura ambiente. Se
hicieron varios cambios de resina pura durante
seis días en agitación constante. La resina fue
polimerizada a 60 °C por 48 horas. Se obtu-
vieron secciones de 0.5-0.7 μm de grosor con
cuchillas de vidrio en un Ultramicrótomo Leica
Ultracut UCT®; las cuales se tiñeron con azul
de Toluidina (TBO) en bórax al 1 %, pH 3.6
por 30-60 segundos que además de permitir la
descripción entre tejidos de pared primaria y
secundaria, permite diferenciar esporopolenina
y de manera no especifica polifenoles totales
(Rincón-Barón et al., 2020; Rincón-Barón et
al., 2021a). Tanto las secciones en parafina
como las de resina se examinaron con un
microscopio fotónico Nikon eclipse Ni equi-
pado con el sistema de contraste diferencial
de interferencia (CDI). Muestras de las anteras
maduras procesadas en parafina y teñidas con
Safranina Azul de Alcian fueron examinadas
empleando el filtro de triple banda de excita-
ción DAPI-FITC-Texas, el cual incorpora un
filtro de excitación con ventanas de paso de
banda angostas en las regiones espectrales vio-
leta (395-410 nm), azul (490-505 nm) y verde
(560-580 nm). Las fotografías se obtuvieron
con cámara digital Nikon DS-Fi1® utilizando
el programa NIS Elements versión 4.30.02
de Nikon.
Así mismo y aplicando el procesamiento
descrito anteriormente se hicieron secciones