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Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
Microsporogénesis y ultraestructura de los granos de polen
en la planta del cacao, Theobroma cacao (Malvaceae)
Edgar Javier Rincón-Barón1*; https://orcid.org/0000-0003-1347-171X
Gerardo Andrés Torres-Rodríguez2; https://orcid.org/0000-0003-2381-2936
Viviana Lucia Cuarán3; https://orcid.org/0000-0001-7295-0046
René Carreño-Olejua3; https://orcid.org/0000-0001-8818-565X
Lilian M. Passarelli4; https://orcid.org/0000-0002-8870-8622
1. Universidad de Santander, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud y Facultad de Ciencias Naturales, Grupo
de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas para la Sostenibilidad-CIBAS, calle 70 No 55-210, Campus
Universitario Lagos del Cacique, Bucaramanga, Colombia; ed.rincon@mail.udes.edu.co (*Correspondencia)
2. Unidad de Microscopía Electrónica, Universidad del Cauca, carrera 2 # 1A-25 Museo de Historia Natural, Popayán,
Cauca, Colombia; gator@unicauca.edu.co
3. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA), Centro de Investigación La Suiza, Km. 32,
vía al mar, Vereda Galápagos, Rionegro, Santander, Colombia; vcuaran@agrosavia.co, acarreno@agrosavia.co
4. Laboratorio de Estudios de Anatomía Vegetal Evolutiva y Sistemática (LEAVES), Facultad de Ciencias Naturales y
Museo de La Plata, 64 entre 120 y diagonal 113, B1904 E, Universidad Nacional de la Plata, La Plata, Argentina;
lmpassarelli@yahoo.com.ar
Recibido 24-V-2022. Corregido 07-XI-2022. Aceptado 23-II-2023.
ABSTRACT
Microsporogenesis and ultrastructure of pollen grains in the cocoa plant, Theobroma cacao (Malvaceae)
Introduction: We know of no studies on the microsporogenesis of the cocoa plant, and little is known about the
ultrastructure of its pollen grains.
Objective: To describe microsporogenesis and ultrastructure of pollen grains in T. cacao.
Methods: We processed over 30 flowers for each floral stage and stained with Safranin-Alcian Blue, PAS-
Amidoblack and Lacmoid. For transmission microscopy we processed samples on resin and stained with tolu-
idine blue. For scanning electron microscopy, we fixed and dehydrated in 2.2-dimethoxypropane, critically dried
and coated with gold.
Results: Anthers differentiated by a cellular mass at the ends distal to the staminal filaments. During devel-
opment, the anther wall has several cellular layers reduced, at maturity, to the epidermis and endothecium.
Microspore mother cells divide by meiosis to form tetrads. The tapetum is secretory and intact until the grains
are released, to later degenerate. Pollen grains are isopolar, spheroidal, small, tricolpate. Ultrastructure has a
semi-tectate sporodermis, with reticulate ornamentation, and heterobrochated reticulum with the muri without
ornamentation. Exine is deposited before intine. The orbicles are individual, smooth, and varied in size. There
is abundant pollenkitt on the tectum and between the columellae. The intine is thin, but develops widely in the
colpus areas, forming a compact internal intine and an unusual external intine with a columellated appearance.
Conclusion: Anther structure and development follows the angiosperm pattern. Simultaneous microsporogen-
esis and centripetal deposition of the sporodermis are known from Malvaceae, but intine characters are novel
for the family.
Key words: cocoa; Malvaceae; microspore; palynology; pollen ontogeny; sporodermis; tapetum.
https://doi.org/10.15517/rev.biol.trop..v71i1.51101
BOTÁNICA Y MICOLOGÍA
2Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
INTRODUCCIÓN
Theobroma cacao L. es una planta amplia-
mente cultivada y distribuida en las zonas tro-
picales del mundo. Actualmente se encuentra
en la familia Malvaceae (Bayer et al., 1999;
Bayer & Kubitzki, 2003; Bhattacharjee, 2018;
Richardson et al., 2015) y circunscrita a la
subfamilia Byttnerioidea (Bayer et al., 1999;
Bayer & Kubitzki, 2003). T. cacao es un cul-
tivo tropical de importancia económica dado
que los cotiledones de sus semillas son la
materia prima para la industria de chocolates,
la producción de manteca y cacao en polvo;
las cuales son industrias multimillonarias que
consumen el grueso de la producción mundial
(Squicciarini & Swinnen, 2016; Wickramasuri-
ya & Dunwell, 2018).
A pesar de la importancia económica de
T. cacao, son escasos los trabajos relacionados
con la comprensión de su biología reproductiva;
algunos de estos tienen en cuenta el desarrollo
y la morfología floral, viabilidad del polen,
polinizadores y mecanismos de compatibilidad
(Bayer & Kubitzki, 2003; Bridgemohan et al.,
2017; de Jesus-Branco, et al., 2018; Ford &
Wilkinson, 2012; Lanaud et al., 2017; López et
al., 2018; Narayanapur et al., 2018; N’Zi, et al.,
2017; Rangel et al., 2012; Rincón-Barón et al.,
2021a; Swanson et al., 2008). Si bien es cierto
que se han hecho esfuerzos en la descripción
de la microsporogénesis en algunas Malvaceae
(Galati & Rosenfeldt, 1998; Lattar et al., 2012;
Lattar et al., 2014; Rincón-Barón et al., 2021a;
Tang et al., 2006; Tang et al., 2009) en T. cacao
es poco lo que se conoce y la mayoría de los
estudios solo documentan brevemente algunos
aspectos de este proceso, por lo cual los even-
tos que marcan la formación de los granos de
polen en esta especie permanecen aún sin resol-
ver (Rincón-Barón et al., 2021b; Sivachandran
et al., 2017). Es importante indicar que conocer
y entender los procesos de microsporogénesis
en plantas ayudan en la comprensión de los pro-
cesos evolutivos y relaciones filogenéticas de
este grupo de organismos (Furness et al., 2002;
Nadot et al., 2008). Así mismo, es importante
conocer a cabalidad la biología reproductiva
de plantas como T. cacao dada su importancia
económica que la ha llevado a convertirse en
el sustento económico de muchas familias en
las regiones tropicales (Abbott et al., 2018;
Antolinez et al., 2020; Beg et al., 2017; Osorio
et al., 2017; Sánchez et al., 2019; Squicciarini
RESUMEN
Introducción: No conocemos estudios sobre la microsporogénesis de la planta de cacao, y poco se sabe sobre la
ultraestructura de sus granos de polen.
Objetivo: Describir la microsporogénesis y ultraestructura de los granos de polen en T. cacao.
Métodos: Procesamos más de 30 flores para cada etapa floral, teñidas con Safranina-Azul Alcian, PAS-
Amidoblack y Lacmoid. Para la microscopía de transmisión procesamos las muestras en resina y las teñimos
con azul de toluidina. Para microscopía electrónica de barrido, fijamos y deshidratamos en 2.2-dimetoxipropano,
secamos hasta un punto crítico y recubrimos con oro.
Resultados: Anteras diferenciadas por una masa celular en los extremos distales a los filamentos estaminales.
Durante el desarrollo la pared de las anteras presenta varios estratos celulares y al madurar se reducen a la epi-
dermis y al endotecio. Las células madre de microsporas se dividen por meiosis para formar tétradas. El tapete
es secretor e intacto hasta que se liberan los granos, para luego degenerar. Los granos de polen son isopolares,
esferoidales, pequeños, tricolpados. La ultraestructura presenta una esporodermis semitectada, con ornamenta-
ción reticulada, y un retículo heterobrochado con el muri sin ornamentación. La exina se deposita antes que la
intina. Los orbículos son individuales, lisos y de tamaño variado. Hay abundante polenkit en el tectum y entre
las columelas. La intina es delgada, pero se desarrolla ampliamente en las áreas del colpo, formando una intina
interna compacta y una intina externa inusual con una apariencia columelada.
Conclusión: La estructura y el desarrollo de las anteras siguen el patrón de las angiospermas. La microsporogé-
nesis simultánea y la deposición centrípeta de la esporodermis se conocen de Malvaceae, pero los caracteres de
la intina son nuevos para la familia.
Palabras clave: cacao; esporodermis; Malvaceae; microspora; ontogenia del polen; palinología; tapete.
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& Swinnen, 2016; Wickramasuriya & Dunwell,
2018). Atendiendo a estas razones, en este tra-
bajo de investigación se realiza una descripción
pormenorizada de los mecanismos ontogenéti-
cos de la formación de los granos de polen de
T. cacao, haciendo énfasis en la arquitectura
y morfología de las células arquesporiales,
células madre de las microsporas, formación y
estructura de la pared de las anteras, descrip-
ción del patrón de microsporogénesis, forma-
ción de la esporodermis, estructura y función
del tapete, micromorfología y ultraestructura
de los granos de polen.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se tomaron más de 30 flores por cada
etapa del desarrollo floral empleando el geno-
tipo CCN 51 (Colección Castro-Naranjal) por
ser ampliamente cultivado. Las muestras fue-
ron obtenidas del banco de germoplasma ex
situ del Centro de Investigaciones La Suiza
de la Corporación Colombiana de Investiga-
ción Agropecuaria (Agrosavia) ubicado en el
Municipio de Rionegro, Santander-Colombia
a 540 m de altitud (7°22’12” N & 73°11’39”
W) durante los meses de junio-julio del 2021.
Las flores se fijaron en una mezcla de formol,
etanol y ácido acético (FAA) por 24-48 horas a
6 °C. Posteriormente, se deshidrataron en una
serie gradual de etanol y dos pasos de aclara-
miento en Xilol (Ruzin, 1999) y se incluye-
ron en Paraplast plus (McCormick®) durante
12 horas a 55 °C. Se obtuvieron secciones
transversales y longitudinales con micrótomo
rotatorio LEICA RM® 2125, entre 4-5 μm de
grosor. Se procedió a la tinción de las muestras
con Safranina-azul de Alcian para distinguir
estructuras con paredes primarias y secundarias
y de manera no específica presencia de poli-
fenoles totales. Adicionalmente, muestras de
las flores con anteras maduras también fueron
teñidas con la técnica de PAS (ácido peryó-
dico de Schiff-Amidoblack) para discriminar
entre polisacáridos estructurales y de reserva,
además de la presencia de proteínas. Se utili-
zó Lacmoid para teñir calosa y determinar el
patrón de microsporogénesis. Para todas las
tinciones se procedió de acuerdo a literatura
especializada (Demarco, 2017; Ramming et
al., 1973; Rincón-Barón et al., 2020; Rincón-
Barón et al., 2021a; Ruzin, 1999; Soukup,
2014). Muestras adicionales en los diferentes
momentos del desarrollo floral fueron fijadas
en Glutaraldehído al 2.5 % en buffer fosfato
0.2 M pH 7.2 durante 24-48 horas a 6 °C.
Luego de la fijación, las muestras se lavaron en
el mismo buffer seguido de agua destilada para
posteriormente postfijarlas con Tetróxido de
Osmio al 2 % por 2 horas a 6 °C en oscuridad
y agitación constante. Finalmente, las muestras
se deshidrataron durante una hora en una serie
gradual de etanol y durante 12 horas etanol al
100 %. Las muestras se embebieron en mezclas
progresivas de óxido de propileno-resina Spurr,
por una semana a temperatura ambiente. Se
hicieron varios cambios de resina pura durante
seis días en agitación constante. La resina fue
polimerizada a 60 °C por 48 horas. Se obtu-
vieron secciones de 0.5-0.7 μm de grosor con
cuchillas de vidrio en un Ultramicrótomo Leica
Ultracut UCT®; las cuales se tiñeron con azul
de Toluidina (TBO) en bórax al 1 %, pH 3.6
por 30-60 segundos que además de permitir la
descripción entre tejidos de pared primaria y
secundaria, permite diferenciar esporopolenina
y de manera no especifica polifenoles totales
(Rincón-Barón et al., 2020; Rincón-Barón et
al., 2021a). Tanto las secciones en parafina
como las de resina se examinaron con un
microscopio fotónico Nikon eclipse Ni equi-
pado con el sistema de contraste diferencial
de interferencia (CDI). Muestras de las anteras
maduras procesadas en parafina y teñidas con
Safranina Azul de Alcian fueron examinadas
empleando el filtro de triple banda de excita-
ción DAPI-FITC-Texas, el cual incorpora un
filtro de excitación con ventanas de paso de
banda angostas en las regiones espectrales vio-
leta (395-410 nm), azul (490-505 nm) y verde
(560-580 nm). Las fotografías se obtuvieron
con cámara digital Nikon DS-Fi1® utilizando
el programa NIS Elements versión 4.30.02
de Nikon.
Así mismo y aplicando el procesamiento
descrito anteriormente se hicieron secciones
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ultrafinas de 70 a 90 nm de grosor con cuchilla
de diamante para microscopía electrónica de
transmisión (MET) con el fin de detallar la
pared de los granos de polen maduros. Estas
secciones se contrastaron con acetato de uranilo
y citrato de plomo durante 10 min y 5 min res-
pectivamente y se observaron con un microsco-
pio de transmisión JEOL JEM 1200EX.
Para llevar a cabo las descripciones morfo-
lógicas de los granos de polen con microscopía
electrónica de barrido (MEB), se tomaron las
anteras de la colección de germoplasma, las
cuales se deshidrataron en 2.2 Dimetoxipro-
pano acidificado por 2 a 3 días, realizando un
cambio del solvente durante este tiempo (Hal-
britter et al., 2018). Finalmente, se hicieron dos
cambios en etanol absoluto durante 30 minutos
cada uno y se procedió a desecar al punto
crítico con un desecador SAMDRI®-795. Las
muestras se montaron sobre cinta conductiva
de carbono de doble cara y se recubrieron con
oro en una ionizadora DENTON VACUUM
DESK IV durante 10 minutos. Las observa-
ciones y registro fotográfico se realizaron en
un microscopio electrónico de barrido JEOL
JSM-6490LV. Para las descripciones en general
se utilizaron los términos sensu Halbritter et al.
(2018), Punt et al. (2007) y Crang et al. (2018).
Las medidas de los granos de polen maduros
están representadas por la medida mínima,
media y medida máxima utilizando un N = 30.
RESULTADOS
En T. cacao se lograron diferenciar siete
estadios del desarrollo floral que se corre-
lacionan perfectamente con los principales
eventos del proceso de microsporogénesis (Fig.
1A). Las secciones del estadio más inmaduro
estudiado revelan la presencia y formación
de filamentos estaminales en cuyo extremo se
aprecia una masa celular diferenciada, consti-
tuida por el tejido arquespórico, formado por
células con abundante citoplasma de aspecto
vacuolado y granular, un núcleo voluminoso
en posición central y en éste se puede apreciar
por lo general un nucleolo (Fig. 1B). A partir
de esta masa de tejido arquespórico también se
formará la pared de las anteras que para este
momento del desarrollo floral está constituida
por una capa de varios estratos celulares (Fig.
1B). Las capas celulares más internas que deli-
mitan al tejido arquespórico son de contorno
entre cuadrado a rectangular, con la presencia
de una vacuola que ocupa la mayor parte del
citoplasma y un núcleo en posición excéntrica
en el cual se aprecia un nucléolo (Fig. 1B).
El siguiente estrato celular de esta pared está
formado por una capa de dos o tres células de
grosor, muy similares en sus características
citológicas a las células anteriormente descri-
tas, pero con contorno más aplanado (Fig. 1B).
La capa más externa de células epidérmicas
que recubre el primordio de la antera posee
contorno cuadrado, con una vacuola grande
que ocupa la mayor parte del citoplasma y un
núcleo en posición excéntrica; en esta capa es
posible observar abundante acumulación de
polifenoles almacenados principalmente en el
citoplasma (Fig. 1B). A medida que las ante-
ras crecen y se desarrollan a partir del tejido
arquespórico se forman las células madre de
las microsporas, y las paredes de las anteras
se encuentran formadas por la capa uniestra-
tificada epidérmica claramente diferenciada
con abundantes polifenoles y una capa interna
de dos o tres estratos celulares parietales de
contorno cuadrado a rectangular (Fig. 1C); a
partir de este estrato de células más interna se
diferenciará el tapete. Las células madre de las
microsporas se encuentran densamente empa-
quetadas en el lóculo microsporangial (Fig.
1C); estas células son de contorno globoso con
una pared gruesa y el citoplasma se aprecia
granular. Después de experimentar citocinesis
meiótica simultánea las células madre de las
microsporas forman tétrades de microsporas
en disposición tetraédrica (Fig. 1D, Fig. 1E).
Estas células se caracterizan por su contorno
ovalado con un núcleo voluminoso en posición
central, con uno o dos nucleolos y citoplasma
de aspecto vacuolado y granular (Fig. 1E). Las
microsporas en la tétrade están cubiertas por
una gruesa capa de calosa que se aprecia en
color azul claro al teñir con Lacmoid (Fig. 1D).
Así mismo, para este momento del desarrollo