1
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
Microsporogénesis y ultraestructura de los granos de polen
en la planta del cacao, Theobroma cacao (Malvaceae)
Edgar Javier Rincón-Barón1*; https://orcid.org/0000-0003-1347-171X
Gerardo Andrés Torres-Rodríguez2; https://orcid.org/0000-0003-2381-2936
Viviana Lucia Cuarán3; https://orcid.org/0000-0001-7295-0046
René Carreño-Olejua3; https://orcid.org/0000-0001-8818-565X
Lilian M. Passarelli4; https://orcid.org/0000-0002-8870-8622
1. Universidad de Santander, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud y Facultad de Ciencias Naturales, Grupo
de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas para la Sostenibilidad-CIBAS, calle 70 No 55-210, Campus
Universitario Lagos del Cacique, Bucaramanga, Colombia; ed.rincon@mail.udes.edu.co (*Correspondencia)
2. Unidad de Microscopía Electrónica, Universidad del Cauca, carrera 2 # 1A-25 Museo de Historia Natural, Popayán,
Cauca, Colombia; gator@unicauca.edu.co
3. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA), Centro de Investigación La Suiza, Km. 32,
vía al mar, Vereda Galápagos, Rionegro, Santander, Colombia; vcuaran@agrosavia.co, acarreno@agrosavia.co
4. Laboratorio de Estudios de Anatomía Vegetal Evolutiva y Sistemática (LEAVES), Facultad de Ciencias Naturales y
Museo de La Plata, 64 entre 120 y diagonal 113, B1904 E, Universidad Nacional de la Plata, La Plata, Argentina;
lmpassarelli@yahoo.com.ar
Recibido 24-V-2022. Corregido 07-XI-2022. Aceptado 23-II-2023.
ABSTRACT
Microsporogenesis and ultrastructure of pollen grains in the cocoa plant, Theobroma cacao (Malvaceae)
Introduction: We know of no studies on the microsporogenesis of the cocoa plant, and little is known about the
ultrastructure of its pollen grains.
Objective: To describe microsporogenesis and ultrastructure of pollen grains in T. cacao.
Methods: We processed over 30 flowers for each floral stage and stained with Safranin-Alcian Blue, PAS-
Amidoblack and Lacmoid. For transmission microscopy we processed samples on resin and stained with tolu-
idine blue. For scanning electron microscopy, we fixed and dehydrated in 2.2-dimethoxypropane, critically dried
and coated with gold.
Results: Anthers differentiated by a cellular mass at the ends distal to the staminal filaments. During devel-
opment, the anther wall has several cellular layers reduced, at maturity, to the epidermis and endothecium.
Microspore mother cells divide by meiosis to form tetrads. The tapetum is secretory and intact until the grains
are released, to later degenerate. Pollen grains are isopolar, spheroidal, small, tricolpate. Ultrastructure has a
semi-tectate sporodermis, with reticulate ornamentation, and heterobrochated reticulum with the muri without
ornamentation. Exine is deposited before intine. The orbicles are individual, smooth, and varied in size. There
is abundant pollenkitt on the tectum and between the columellae. The intine is thin, but develops widely in the
colpus areas, forming a compact internal intine and an unusual external intine with a columellated appearance.
Conclusion: Anther structure and development follows the angiosperm pattern. Simultaneous microsporogen-
esis and centripetal deposition of the sporodermis are known from Malvaceae, but intine characters are novel
for the family.
Key words: cocoa; Malvaceae; microspore; palynology; pollen ontogeny; sporodermis; tapetum.
https://doi.org/10.15517/rev.biol.trop..v71i1.51101
BOTÁNICA Y MICOLOGÍA
2Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
INTRODUCCIÓN
Theobroma cacao L. es una planta amplia-
mente cultivada y distribuida en las zonas tro-
picales del mundo. Actualmente se encuentra
en la familia Malvaceae (Bayer et al., 1999;
Bayer & Kubitzki, 2003; Bhattacharjee, 2018;
Richardson et al., 2015) y circunscrita a la
subfamilia Byttnerioidea (Bayer et al., 1999;
Bayer & Kubitzki, 2003). T. cacao es un cul-
tivo tropical de importancia económica dado
que los cotiledones de sus semillas son la
materia prima para la industria de chocolates,
la producción de manteca y cacao en polvo;
las cuales son industrias multimillonarias que
consumen el grueso de la producción mundial
(Squicciarini & Swinnen, 2016; Wickramasuri-
ya & Dunwell, 2018).
A pesar de la importancia económica de
T. cacao, son escasos los trabajos relacionados
con la comprensión de su biología reproductiva;
algunos de estos tienen en cuenta el desarrollo
y la morfología floral, viabilidad del polen,
polinizadores y mecanismos de compatibilidad
(Bayer & Kubitzki, 2003; Bridgemohan et al.,
2017; de Jesus-Branco, et al., 2018; Ford &
Wilkinson, 2012; Lanaud et al., 2017; López et
al., 2018; Narayanapur et al., 2018; N’Zi, et al.,
2017; Rangel et al., 2012; Rincón-Barón et al.,
2021a; Swanson et al., 2008). Si bien es cierto
que se han hecho esfuerzos en la descripción
de la microsporogénesis en algunas Malvaceae
(Galati & Rosenfeldt, 1998; Lattar et al., 2012;
Lattar et al., 2014; Rincón-Barón et al., 2021a;
Tang et al., 2006; Tang et al., 2009) en T. cacao
es poco lo que se conoce y la mayoría de los
estudios solo documentan brevemente algunos
aspectos de este proceso, por lo cual los even-
tos que marcan la formación de los granos de
polen en esta especie permanecen aún sin resol-
ver (Rincón-Barón et al., 2021b; Sivachandran
et al., 2017). Es importante indicar que conocer
y entender los procesos de microsporogénesis
en plantas ayudan en la comprensión de los pro-
cesos evolutivos y relaciones filogenéticas de
este grupo de organismos (Furness et al., 2002;
Nadot et al., 2008). Así mismo, es importante
conocer a cabalidad la biología reproductiva
de plantas como T. cacao dada su importancia
económica que la ha llevado a convertirse en
el sustento económico de muchas familias en
las regiones tropicales (Abbott et al., 2018;
Antolinez et al., 2020; Beg et al., 2017; Osorio
et al., 2017; Sánchez et al., 2019; Squicciarini
RESUMEN
Introducción: No conocemos estudios sobre la microsporogénesis de la planta de cacao, y poco se sabe sobre la
ultraestructura de sus granos de polen.
Objetivo: Describir la microsporogénesis y ultraestructura de los granos de polen en T. cacao.
Métodos: Procesamos más de 30 flores para cada etapa floral, teñidas con Safranina-Azul Alcian, PAS-
Amidoblack y Lacmoid. Para la microscopía de transmisión procesamos las muestras en resina y las teñimos
con azul de toluidina. Para microscopía electrónica de barrido, fijamos y deshidratamos en 2.2-dimetoxipropano,
secamos hasta un punto crítico y recubrimos con oro.
Resultados: Anteras diferenciadas por una masa celular en los extremos distales a los filamentos estaminales.
Durante el desarrollo la pared de las anteras presenta varios estratos celulares y al madurar se reducen a la epi-
dermis y al endotecio. Las células madre de microsporas se dividen por meiosis para formar tétradas. El tapete
es secretor e intacto hasta que se liberan los granos, para luego degenerar. Los granos de polen son isopolares,
esferoidales, pequeños, tricolpados. La ultraestructura presenta una esporodermis semitectada, con ornamenta-
ción reticulada, y un retículo heterobrochado con el muri sin ornamentación. La exina se deposita antes que la
intina. Los orbículos son individuales, lisos y de tamaño variado. Hay abundante polenkit en el tectum y entre
las columelas. La intina es delgada, pero se desarrolla ampliamente en las áreas del colpo, formando una intina
interna compacta y una intina externa inusual con una apariencia columelada.
Conclusión: La estructura y el desarrollo de las anteras siguen el patrón de las angiospermas. La microsporogé-
nesis simultánea y la deposición centrípeta de la esporodermis se conocen de Malvaceae, pero los caracteres de
la intina son nuevos para la familia.
Palabras clave: cacao; esporodermis; Malvaceae; microspora; ontogenia del polen; palinología; tapete.
3
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
& Swinnen, 2016; Wickramasuriya & Dunwell,
2018). Atendiendo a estas razones, en este tra-
bajo de investigación se realiza una descripción
pormenorizada de los mecanismos ontogenéti-
cos de la formación de los granos de polen de
T. cacao, haciendo énfasis en la arquitectura
y morfología de las células arquesporiales,
células madre de las microsporas, formación y
estructura de la pared de las anteras, descrip-
ción del patrón de microsporogénesis, forma-
ción de la esporodermis, estructura y función
del tapete, micromorfología y ultraestructura
de los granos de polen.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se tomaron más de 30 flores por cada
etapa del desarrollo floral empleando el geno-
tipo CCN 51 (Colección Castro-Naranjal) por
ser ampliamente cultivado. Las muestras fue-
ron obtenidas del banco de germoplasma ex
situ del Centro de Investigaciones La Suiza
de la Corporación Colombiana de Investiga-
ción Agropecuaria (Agrosavia) ubicado en el
Municipio de Rionegro, Santander-Colombia
a 540 m de altitud (7°22’12” N & 73°11’39”
W) durante los meses de junio-julio del 2021.
Las flores se fijaron en una mezcla de formol,
etanol y ácido acético (FAA) por 24-48 horas a
6 °C. Posteriormente, se deshidrataron en una
serie gradual de etanol y dos pasos de aclara-
miento en Xilol (Ruzin, 1999) y se incluye-
ron en Paraplast plus (McCormick®) durante
12 horas a 55 °C. Se obtuvieron secciones
transversales y longitudinales con micrótomo
rotatorio LEICA RM® 2125, entre 4-5 μm de
grosor. Se procedió a la tinción de las muestras
con Safranina-azul de Alcian para distinguir
estructuras con paredes primarias y secundarias
y de manera no específica presencia de poli-
fenoles totales. Adicionalmente, muestras de
las flores con anteras maduras también fueron
teñidas con la técnica de PAS (ácido peryó-
dico de Schiff-Amidoblack) para discriminar
entre polisacáridos estructurales y de reserva,
además de la presencia de proteínas. Se utili-
zó Lacmoid para teñir calosa y determinar el
patrón de microsporogénesis. Para todas las
tinciones se procedió de acuerdo a literatura
especializada (Demarco, 2017; Ramming et
al., 1973; Rincón-Barón et al., 2020; Rincón-
Barón et al., 2021a; Ruzin, 1999; Soukup,
2014). Muestras adicionales en los diferentes
momentos del desarrollo floral fueron fijadas
en Glutaraldehído al 2.5 % en buffer fosfato
0.2 M pH 7.2 durante 24-48 horas a 6 °C.
Luego de la fijación, las muestras se lavaron en
el mismo buffer seguido de agua destilada para
posteriormente postfijarlas con Tetróxido de
Osmio al 2 % por 2 horas a 6 °C en oscuridad
y agitación constante. Finalmente, las muestras
se deshidrataron durante una hora en una serie
gradual de etanol y durante 12 horas etanol al
100 %. Las muestras se embebieron en mezclas
progresivas de óxido de propileno-resina Spurr,
por una semana a temperatura ambiente. Se
hicieron varios cambios de resina pura durante
seis días en agitación constante. La resina fue
polimerizada a 60 °C por 48 horas. Se obtu-
vieron secciones de 0.5-0.7 μm de grosor con
cuchillas de vidrio en un Ultramicrótomo Leica
Ultracut UCT®; las cuales se tiñeron con azul
de Toluidina (TBO) en bórax al 1 %, pH 3.6
por 30-60 segundos que además de permitir la
descripción entre tejidos de pared primaria y
secundaria, permite diferenciar esporopolenina
y de manera no especifica polifenoles totales
(Rincón-Barón et al., 2020; Rincón-Barón et
al., 2021a). Tanto las secciones en parafina
como las de resina se examinaron con un
microscopio fotónico Nikon eclipse Ni equi-
pado con el sistema de contraste diferencial
de interferencia (CDI). Muestras de las anteras
maduras procesadas en parafina y teñidas con
Safranina Azul de Alcian fueron examinadas
empleando el filtro de triple banda de excita-
ción DAPI-FITC-Texas, el cual incorpora un
filtro de excitación con ventanas de paso de
banda angostas en las regiones espectrales vio-
leta (395-410 nm), azul (490-505 nm) y verde
(560-580 nm). Las fotografías se obtuvieron
con cámara digital Nikon DS-Fi1® utilizando
el programa NIS Elements versión 4.30.02
de Nikon.
Así mismo y aplicando el procesamiento
descrito anteriormente se hicieron secciones
4Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
ultrafinas de 70 a 90 nm de grosor con cuchilla
de diamante para microscopía electrónica de
transmisión (MET) con el fin de detallar la
pared de los granos de polen maduros. Estas
secciones se contrastaron con acetato de uranilo
y citrato de plomo durante 10 min y 5 min res-
pectivamente y se observaron con un microsco-
pio de transmisión JEOL JEM 1200EX.
Para llevar a cabo las descripciones morfo-
lógicas de los granos de polen con microscopía
electrónica de barrido (MEB), se tomaron las
anteras de la colección de germoplasma, las
cuales se deshidrataron en 2.2 Dimetoxipro-
pano acidificado por 2 a 3 días, realizando un
cambio del solvente durante este tiempo (Hal-
britter et al., 2018). Finalmente, se hicieron dos
cambios en etanol absoluto durante 30 minutos
cada uno y se procedió a desecar al punto
crítico con un desecador SAMDRI®-795. Las
muestras se montaron sobre cinta conductiva
de carbono de doble cara y se recubrieron con
oro en una ionizadora DENTON VACUUM
DESK IV durante 10 minutos. Las observa-
ciones y registro fotográfico se realizaron en
un microscopio electrónico de barrido JEOL
JSM-6490LV. Para las descripciones en general
se utilizaron los términos sensu Halbritter et al.
(2018), Punt et al. (2007) y Crang et al. (2018).
Las medidas de los granos de polen maduros
están representadas por la medida mínima,
media y medida máxima utilizando un N = 30.
RESULTADOS
En T. cacao se lograron diferenciar siete
estadios del desarrollo floral que se corre-
lacionan perfectamente con los principales
eventos del proceso de microsporogénesis (Fig.
1A). Las secciones del estadio más inmaduro
estudiado revelan la presencia y formación
de filamentos estaminales en cuyo extremo se
aprecia una masa celular diferenciada, consti-
tuida por el tejido arquespórico, formado por
células con abundante citoplasma de aspecto
vacuolado y granular, un núcleo voluminoso
en posición central y en éste se puede apreciar
por lo general un nucleolo (Fig. 1B). A partir
de esta masa de tejido arquespórico también se
formará la pared de las anteras que para este
momento del desarrollo floral está constituida
por una capa de varios estratos celulares (Fig.
1B). Las capas celulares más internas que deli-
mitan al tejido arquespórico son de contorno
entre cuadrado a rectangular, con la presencia
de una vacuola que ocupa la mayor parte del
citoplasma y un núcleo en posición excéntrica
en el cual se aprecia un nucléolo (Fig. 1B).
El siguiente estrato celular de esta pared está
formado por una capa de dos o tres células de
grosor, muy similares en sus características
citológicas a las células anteriormente descri-
tas, pero con contorno más aplanado (Fig. 1B).
La capa más externa de células epidérmicas
que recubre el primordio de la antera posee
contorno cuadrado, con una vacuola grande
que ocupa la mayor parte del citoplasma y un
núcleo en posición excéntrica; en esta capa es
posible observar abundante acumulación de
polifenoles almacenados principalmente en el
citoplasma (Fig. 1B). A medida que las ante-
ras crecen y se desarrollan a partir del tejido
arquespórico se forman las células madre de
las microsporas, y las paredes de las anteras
se encuentran formadas por la capa uniestra-
tificada epidérmica claramente diferenciada
con abundantes polifenoles y una capa interna
de dos o tres estratos celulares parietales de
contorno cuadrado a rectangular (Fig. 1C); a
partir de este estrato de células más interna se
diferenciará el tapete. Las células madre de las
microsporas se encuentran densamente empa-
quetadas en el lóculo microsporangial (Fig.
1C); estas células son de contorno globoso con
una pared gruesa y el citoplasma se aprecia
granular. Después de experimentar citocinesis
meiótica simultánea las células madre de las
microsporas forman tétrades de microsporas
en disposición tetraédrica (Fig. 1D, Fig. 1E).
Estas células se caracterizan por su contorno
ovalado con un núcleo voluminoso en posición
central, con uno o dos nucleolos y citoplasma
de aspecto vacuolado y granular (Fig. 1E). Las
microsporas en la tétrade están cubiertas por
una gruesa capa de calosa que se aprecia en
color azul claro al teñir con Lacmoid (Fig. 1D).
Así mismo, para este momento del desarrollo
5
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
floral en la pared de las anteras se aprecia el
estrato epidérmico, una capa celular inmedia-
tamente yuxtapuesta interna de contorno entre
cuadrado y rectangular que se diferenciará
posteriormente en el endotecio, una capa de
células aplanadas que delimita internamente
con el tapete secretor que a su vez está forma-
do por una capa uniestratificada de células de
Fig. 1. Microsporogénesis de Theobroma cacao. A. Estadios del desarrollo floral. B. Región apical del filamento estaminal.
Se aprecia el tejido arquespórico que formará a las células madre de las microsporas (TBO). C. Anteras diferenciadas. Se
detallan las células madre de las microsporas (TBO). D. Tétrades tetraédricas de microsporas. Se aprecia el tapete celular
y calosa alrededor de las microsporas y de las tétrades (Lacmoid) E. Detalles de las tétrades tetraédricas de microsporas,
pared de la antera y tapete secretor (TBO). F-G. Microsporas en maduración (TBO). En F. se aprecia la exina y el tapete
secretor con abundantes orbículas. En G. se distinguen la exina, la intina, el tapete secretor y en la pared de la antera la
epidermis y el endotecio. H. Antera y granos de polen maduros. Se aprecian restos o remanentes del tapete. CA: calosa;
CM: células madre de las microsporas; EF: engrosamientos fibrilares; EN: endotecio; EP: epidermis; EX: exina; FI:
filamento estaminal; IN: intina; MI: microsporas; NU: núcleo de la microspora; OR: orbículas; PA: pared de la antera; PF:
polifenoles; Pl: polen; RT: restos de las células del tapete; TA: tejido arquespórico; TC: tapete secretor; TR: tétrades polínicas
tetraédricas. / Fig. 1. Theobroma cacao microsporogenesis. A. Stages of floral development. B. Apical region of staminal
filament. The archesporic tissue that will form the mother cells of the microspores can be seen (TBO). C. Differentiated
anthers. Microspore mother cells (TBO) are detailed. D. Tetrahedral tetrads of microspores. The secretory tapetum and
callose around the microspores in the tetrads (Lacmoid) are appreciated. E. Details of the microspore tetrahedral tetrads,
anther wall, and secretory tapetum (TBO). F-G. Mature microspores (TBO). In F., the exine and the secretory tapetum with
abundant orbicules can be seen. In G. the exine, the intine, the secretory tapetum, the epidermis and the endothecium are
distinguished. H. Anther and mature pollen grains. Remnants of the cell tapetum can be seen. CA: callose; CM: Microspore
mother cells; EF: fibrillar thickenings; EN: endotecium; EP: epidermis; EX: exine; FI: staminal filament; IN: intine; MI:
microspores; NU: microspore nucleus; OR: orbicules; PA: anther wall; PF: polyphenols; Pl: pollen; RT: remmants of the
tapetal cells; TA: archesporic tissue; TC: secretory tapetum; TR: tetrahedral pollen tetrads.
6Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
y vegetativo. En G., se detalla la estructura de la esporodermis en la zona interabertural, se observa la presencia de abundante
polenkit. En H. se detalla la zona de las aberturas con una intina gruesa compacta y otra intina columelada. Cl: columelas;
CO: colpos; EF: engrosamientos fibrilares; EN: endotecio; ENX: endexina; EP: epidermis; EX: exina; GA: gránulos de
almidón; IC: intina columelada; IN: intina; LU: lumen: MU: muros; NG: núcleo generativo; NV: núcleo vegetativo; OR:
orbículas; PF: polifenoles; PK: polenkit; Pl: polen; RE: retículo; TE: tectum. / Fig. 2. Morphological details and ultrastructure
of Theobroma cacao pollen grains. A. Anthers cross section. Orbicules covering the microsporangial locules cavities and
abundant starch granules in the pollen cytoplasm can be seen (PAS-Amidoblack). B. Pollen grains and orbicules in anthers
(SEM). C. Anthers cross section. Orbicules covering the cavity of the microsporangial locules are seen (DAPI-FITC-Texas
Filter, PAS-Amidoblack). D-E. Pollen grains under SEM. In D., subequatorial view. Colpus and orbicules are appreciated. In
E., detail of the reticulum with its muri and lumens, the orbicules are notable. F-H. Ultrastructural details of pollen grains
under TEM. In F. , the areas of the apertures (asterisks) and the generative and vegetative nuclei can be seen. In G., the
structure of the sporodermis and the pollen grains in the interapertural zone are detailed, the presence of abundant pollenkitt
is observable. In H. the apertural area is detailed, a thick compact intine and a second columellate intine are observed. Cl:
columella; CO: colpus; EF: fibrillar thickenings; EN: endothecium; ENX: endexine; EP: epidermis; EX: exine; GA: starch
granules; IC: columellate intine; IN: intine; LU: lumen: MU: muri; NG: generative nucleus; NV: vegetative nucleus; OR:
orbicules; PF: polyphenols; PK: pollenkitt; Pl: pollen; RE: reticulum; TE: tectum.
Fig. 2. Detalles morfológicos y
ultraestructura de los granos de polen
de Theobroma cacao. A. Sección
trasversal de las anteras. Se aprecian
las orbículas cubriendo la cavidad
de los lóculos microsporangiales
y abundantes gránulos de almidón
en el citoplasma del polen (PAS-
Amidoblack). B. Granos de polen
y orbículas en las anteras (MEB).
C. Sección trasversal de las
anteras. Se aprecian las orbículas
cubriendo la cavidad de los lóculos
microsporangiales (Filtro DAPI-
FITC-Texas, PAS-Amidoblack). D-E.
Granos de polen observados con
MEB. En D, vista subecuatorial. Se
aprecian los colpos y las orbículas. En
E, detalle del retículo con sus muros
y lúmenes, se detallan las orbículas.
F-H. Detalles ultraestructurales de
los granos de polen con TEM. En F.,
se aprecian las zonas de las aberturas
(asteriscos) y los núcleos generativo
7
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
contorno rectangular que limitan internamente
con las tétrades de microsporas (Fig. 1E). Las
microsporas dentro del lóculo microsporangial
forman primero la exina, la cual adquiere un
patrón de ornamentación reticulado que se tiñe
de azul turquesa con Azul de Toluidina (Fig.
1F), se observa un núcleo por cada micros-
pora y el citoplasma es de aspecto granular.
Asociado al tapete secretor, se aprecia una gra-
nulación fina que corresponde a las orbículas
que comparten las características de tinción de
la exina con azul de Toluidina (Fig. 1F). Con
la maduración de las microsporas, se forma la
intina, la cual se aprecia más engrosada en la
zona de las aberturas de las microsporas y se
tiñe de color azul oscuro o violeta con la misma
tinción (Fig. 1G); en tanto que en la pared de
la antera para este momento del desarrollo se
aprecian cuatro estratos celulares uniestratifica-
dos: la epidermis con abundantes depósitos de
polifenoles (Fig. 1F). Debajo de la epidermis,
se localiza el endotecio que corresponde a una
capa uniestratificada de células cuadradas altas
con engrosamientos fibrilares lignificados, pos-
teriormente se observa una capa de células apla-
nadas y finalmente recubriendo el lóculo del
microsporangio el tapete secretor se hace más
conspicuo y sus células adquieren un contorno
entre rectangular y globoso con abundantes
orbículas (Fig. 1F, Fig. 1 G). Para el momento
de la liberación de los granos de polen la exina e
intina han completado su formación, y el tapete
ha degenerado por completo (Fig. 1H).
Los granos de polen maduros presentan
gran cantidad de gránulos de almidón (Fig. 2A)
y sobre los restos de las paredes celulares del
tapete secretor se observan depósitos masivos
de orbículas que recubren toda la pared de los
lóculos de los microsporangios (Fig. 2A). Las
orbículas o cuerpos de Ubish de T. cacao se
presentan en la pared de las anteras principal-
mente sobre los restos del tapete o sobre los
granos de polen (Fig. 2B, Fig. 2D). Las orbí-
culas presentan los mismos patrones de fluo-
rescencia que la exina de los granos de polen
cuando son observados utilizando la tinción de
PAS-Amidoblack y el filtro de triple banda de
excitación DAPI-FITC-Texas, estas estructuras
y la pared de los granos de polen se ven de
color azul-verdoso (Fig. 2C).
Los granos de polen son liberados en
mónades, isopolares, pequeños (16.6) 18 (20.5)
μm con amb circular, esferoidales (Fig. 2D),
tricolpados con colpos breves de 5 μm, con
membrana ornamentada. La estructura de la
esporodermis es semitectada, con ornamen-
tación reticulada, retículos heterobrochados,
muros sin ornamentación, además el retículo
disminuye de tamaño hacia las aberturas redu-
ciendo el tamaño de los lúmenes aunque los
muros mantienen el grosor (0.30 μm) (Fig. 2D,
Fig. 2E). Los corpúsculos de Ubish son indi-
viduales, lisos y de diferentes tamaños (0.3 a
1 μm) (Fig. 2D, Fig. 2E).
Con TEM se observa una ultraestructura
semitectada, la ectexina formada por tectum,
columelas y capa basal que constituye la orna-
mentación reticulada y una endexina muy del-
gada y compacta (Fig. 2G). En el citoplasma se
destacan los núcleos vegetativo y generativo,
siendo en estadio binuclear la forma en que
son liberados los granos de polen (Fig. 2F).
El tectum presenta a la altura de algunas colu-
melas una espina de ápice romo (Fig. 2G), en
esta zona la ectexina alcanza el mayor espesor,
4.2 μm, entre espinas su espesor es de 2 μm,
siendo las columelas simples; se observa ade-
más la endexina (Fig. 2G). El cemento polínico
o polenkit se presenta en forma abundante
sobre el tectum y entre las columelas (Fig. 2H).
La intina muy delgada en la zona intera-
bertural se desarrolla ampliamente en las zonas
de los colpos formando dos capas: una intina
compacta interna y una intina externa que deli-
mita con la exina de apariencia columelada o
con canales electrónicamente densos (Fig. 2H).
DISCUSIÓN
En el presente trabajo se describe por pri-
mera vez la microsporogénesis en T. cacao, se
ha destallado el proceso de diferenciación de
las anteras, la formación y estructura del tapete
secretor y la secuencia centrípeta que conlleva
a la formación de los granos de polen desde
el depósito de la capa más externa de la pared
8Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
polínica que corresponde a la exina, hasta la
más interna, la intina; así mismo se detalla la
ultraestructura de los granos de polen maduros.
En detalle, fue posible observar que en el
extremo distal de los filamentos estaminales
de T. cacao se localiza una masa de tejido
arquespórico que se diferenciará para la forma-
ción de las células madre de las microsporas y
los tejidos vegetativos que formaran la antera
madura que para el momento de la dehiscencia
solo persiste la epidermis y el endotecio; todo
el patrón histológico observado, es similar en
estructura y función al descrito previamente en
Malvaceae y en la mayoría de las angiosper-
mas, situación que muestra un amplio grado
de uniformidad ontogenética de este proceso
en plantas (Fernández et al., 2015; Lattar et al.,
2012; Lattar et al., 2014; Rincón-Barón et al.,
2021b; Scott et al., 2004; Tang et al., 2006; von
Balthazar et al., 2006).
En algunas especies de Malvaceae se ha
registrado la presencia de tapete invasivo no
sincitial, además del plasmodial (Galati et al.,
2007; Galati et al., 2011; Lattar et al., 2014;
Rincón-Barón et al., 2021b; Strittmatter et al.,
2000; Tang et al., 2009); aunque el tapete secre-
tor es el más común en esta familia (Lattar et
al., 2014; Tang et al., 2006) en ambos casos, el
tapete degenera en el momento de la liberación
de los granos de polen, situación que se pudo
apreciar con el tapete secretor en esta investiga-
ción para T. cacao. Dado el estrecho contacto
que se observó entre las células madre de las
microsporas y el tapete secretor de T. cacao, se
apoya la idea de que el tapete estaría facilitando
su maduración y que posteriormente contribuye
con el desarrollo de las microsporas, así como,
proporciona materia prima para la formación
de la esporodermis en especial de la exina
(Fernández et al., 2015; Furness et al., 2002;
Furness & Rudall 2004; Pacini, 2010; Rincón-
Barón et al., 2021b).
En el estadio de células madre de las
microsporas la pared primaria persiste mien-
tras las conexiones citoplasmáticas permiten
sincronizar la división de los microsporocitos
y el avance del proceso en las células tapetales
(Galati et al., 2007; Heslop-Harrison, 1974).
La actividad metabólica en este momento es
notoria por la presencia de diferentes molé-
culas y podría interpretarse como una etapa
necesaria para la formación de calosa (Galati
et al., 2007; Heslop-Harrison, 1966). En T.
cacao la microsporogénesis es simultánea y se
forman tétrades de microsporas en disposición
tetraédrica con una gruesa capa de calosa, este
proceso culmina con la formación de granos de
polen triaberturados, lo cual es ampliamente
conocido en eudicotiledóneas y se explica por
depósitos de calosa y los puntos de contacto
de las microsporas en la tétrade (Furness et
al., 2002; Furness & Rudall, 2004). No obs-
tante, en algunas especies se ha documentado
la presencia de acumulaciones regulares de
calosa durante la formación de las tétrades que
culmina con la formación de granos de polen
pantoporados (Prieu et al., 2019; Rincón-Barón
et al., 2021b).
Se verificó que en T. cacao el depósito de
la esporodermis es centrípeto, lo que impli-
ca, que primero se deposita la exina formada
principalmente de esporopolenina y posterior-
mente se forma la intina que está formada por
componentes de pared primaria, este patrón de
depósito de la esporodermis es coincidente con
el descrito habitualmente en plantas (Blackmo-
re et al., 2007; Pacini & Hesse, 2012; Rincón-
Barón et al., 2021b).
Adicionalmente, se observó que la exina
toma una tinción azul-turquesa por la presencia
de esporopolenina cuando se tiñe con TBO,
en tanto que la intina se tiñe de color violeta
por los componentes de pared primaria, lo
cual es congruente con trabajos anteriores que
indican la utilidad de esta tinción diferencial
para detectar estos compuestos en los granos
de polen e incluso en las esporas de plan-
tas (Rincón-Barón et al., 2020; Rincón-Barón
et al., 2021a).
En T. cacao se pudo evidenciar que en
el estadio de microspora, los precursores de
esporopolenina que se originan en el tapete se
depositan sobre los granos de polen o sobre
las paredes del lóculo microsporangial, por
lo tanto, las orbículas se forman en el mismo
momento que la pared de los granos y estarían
9
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
constituidas por esporopolenina dado que pre-
sentan las mismas reacciones de tinción y
autofluorescencia que la observada para la
exina de la esporodermis, lo cual es similar a
lo registrado previamente para otras especies
e incluso T. cacao (Galati et al., 2007; Gala-
ti et al., 2011; Rincón-Barón et al., 2021a;
Strittmatter & Galati, 2001). Las orbículas son
consideradas primitivas por Verstraete et al.
(2014) y han sido documentadas en la Familia
Malvaceae (Galati & Rosenfeldt, 1998; Lattar
et al., 2014; Rincón-Barón et al., 2021a; Stritt-
matter et al., 2000); su forma es muy variable,
sin embargo, predominan las orbículas lisas
que no mantienen la forma de la ornamentación
de los granos de polen (Ruggiero & Bedini,
2020) algo que se observó también en las orbí-
culas analizadas en T. cacao con una superficie
lisa a microgranulada.
Durante la microsporogénesis de T. cacao
se observó también una amplia producción de
polifenoles, especialmente en los tejidos vege-
tativos de las anteras, un compuesto que predo-
mina en especies de ambientes secos y permite
resistir estas condiciones medio ambientales
(Varela et al., 2016) y que en este caso en par-
ticular permitiría mantener la vitalidad de los
granos de polen al momento de la liberación de
la antera, cuando la deshidratación es severa;
o también se podría relacionar como un meca-
nismos para evitar la herbivoría y el desarrollo
de patógenos en especial hongos (Aime &
Phillips-Mora, 2005; Aoun, 2017; Lattanzio et
al., 2006; Rincón-Barón et al., 2020; Rincón-
Barón et al., 2021a). Se ha registrado para T.
cacao que los polifenoles se acumulan en las
vacuolas principalmente de tejidos epidérmicos
y parenquimatosos (Alean et al., 2020; García
et al., 2014; Rincón-Barón, et al., 2021b) lo
cual es congruente con las observaciones ana-
tómicas realizadas en este trabajo.
En cuanto a los caracteres palinológicos, la
Familia Malvaceae es euripalínica, presentando
amplia diversidad en la morfología del polen
principalmente en el tipo y número de aber-
turas junto a la ornamentación de la ectexina,
propiedades que permiten la diferenciación
de taxones (Bayer & Kubitzki, 2003; Bibi
et al., 2010; Dias & Ribeiro, 2015; Hamdy
& Shamso, 2010; Perveen & Qaiser, 2009;
Rincón-Barón et al., 2021b). Según el APG et
al. (2016) las antiguas Familias Bombacaceae,
Sterculiaceae y Tiliaceae quedaron circunscri-
tas al nivel de subfamilia como son Bombacoi-
deae, Sterculioideae y Tilioideae. Malvaceae
s.s. fue considerada estenopalínica, con polen
habitualmente grande, pantoporado con una
estructura suprareticulada, generalmente con
espinas que pueden tener la base mamelona-
da (Abutilon spp., Hibiscus spp., Malva spp.;
Christensen, 1986) o equinada sin base ensan-
chada (Alcea rosea L.; Rincón-Barón et al.,
2021b). Actualmente T. cacao está circunscrito
a la Subfamilia Byttnerioideae, Tribu Theobro-
mateae junto a Glossotemon Desf., Guazuma
Mill y Herrania Goudot. La morfología palino-
lógica de los géneros de la subfamilia ha sido
escasamente documentada y especialmente en
T. cacao (Rincón-Barón et al., 2021a), por lo
general, la atención ha sido puesta en la poli-
nización y reproducción (López et al., 2018;
Young et al., 1987).
En general los granos de polen de la sub-
familia Byttnerioideae se caracterizan por la
presencia de aberturas simples: poros, o com-
puestas: colporos, y por una ornamentación
reticulada o equinada. Los granos son peque-
ños, reticulados, heterobrochados, colporados
en Glossotemon bruguieri (Ali, 2020) y en
Guazuma ulmifolia Lam. (Ali, 2020; Halbritter
2017). Los granos 3-colpados como los estu-
diados aquí en T. cacao son raros, sólo se han
observado de acuerdo con la bibliografía con-
sultada en una especie de la Familia Malvaceae,
Ceiba pubiflora, Subfamilia Bombacoideae
(Venancio et al., 2022). La estructura semi-
tectada de la pared, remata en ornamentación
supratectal con espinas ubicadas sobre las colu-
melas, carácter frecuente en Malvaceae s.l. Es
destacable la presencia en la zona abertural de
la intina muy engrosada, con una capa compac-
ta interna y una intina externa con canales. Esta
particularidad ha sido mencionada previamente
para la familia, en Waltheria cinerascens A.
St.-Hil., especie que comparte la Subfamilia
Byttneroideae con T. cacao, y único taxón del
10 Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
género Waltheria L. con una intina columelada
(Dias & Ribeiro, 2015), esta inusual caracterís-
tica de la intina se aprecia en un trabajo poste-
rior también en Waltheria, pero los autores no
la mencionan (Amaral et al., 2017).
La intina columelada se ha documentado
en investigaciones previas en la familia que
abarca diferentes especies correspondientes a
grupos no emparentados, en Abutilon hibridum
Voss se destaca una subestructura microfibrilar
en la intina de esta especie, considerado sitio
de almacenamiento de proteínas y proponiendo
la posible vinculación taxonómica del rasgo
(Heslop-Harrison & Heslop-Harrison, 1982).
Al momento de la antesis el grano de polen
maduro se encuentra en estadio dos nuclear,
con la célula generativa libre en el citoplasma
de la célula vegetativa. Brewbaker (1967) men-
ciona a la Familia Malvaceae representada por
Abutilon, Althea, Malva y Gossypium como
polen dos-nuclear, coincidiendo con las obser-
vaciones realizadas aquí que aportan el dato de
T. cacao por primera vez.
Declaración de ética: los autores declaran
que todos están de acuerdo con esta publica-
ción y que han hecho aportes que justifican
su autoría; que no hay conflicto de interés de
ningún tipo; y que han cumplido con todos los
requisitos y procedimientos éticos y legales
pertinentes. Todas las fuentes de financiamien-
to se detallan plena y claramente en la sección
de agradecimientos. El respectivo documento
legal firmado se encuentra en los archivos de
la revista.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a las siguientes
instituciones y personas: a la Universidad de
Santander (UDES) por el apoyo financiero:
Proyecto Fondo Portugal Convenio N° 2035-2
Agrosavia-UDES Valoración integral de los
servicios ecosistémicos asociados al proce-
so de estructuración y recuperación de la
conectividad con sistemas agroforestales con
cacao, y a la Universidad del Cauca (UNICAU-
CA) por su apoyo técnico e infraestructura.
A la Corporación Colombiana de Investiga-
ción Agropecuaria (AGROSAVIA) y al Fondo
ambiental del Ministerio del Medio Ambiente y
Acción Climática de Portugal, en el marco del
proyecto “Mejora de la sostenibilidad ambien-
tal mediante implementación de tecnologías
en el marco de la estrategia nacional para el
cultivo del cacao - ID 1002031”.
REFERENCIAS
Abbott, P. C., Benjamin, T. J., Burniske, G. R., Croft, M.
M., Fenton, M., Kelly, C. R., Lundy, M. M., Rodrí-
guez, C. F., & Wilcox, M. D. (2018). An analysis
of the supply chain of cacao in Colombia. Purdue
University, The International Center for Tropical
Agriculture (CIAT).
Aime, M. C., & Phillips-Mora, W. (2005). The causal
agents of witches’ broom and frosty pod rot of cacao
(chocolate, Theobroma cacao) form a new lineage of
Marasmiaceae. Mycologia, 97(5), 1012–1022.
Alean, J., Chejne, F., Ramírez, S., Rincón, E., Alzate-
Arbelaez, A. F., & Rojano, B. (2020). Proposal of a
method to evaluate the in-situ oxidation of polyphe-
nolic during the cocoa drying. Drying Technology,
40(3), 559–570.
Ali, Z. A. A. (2020). Taxonomic study of Glossostemon
bruguieri desf. (Malvaceae) in Iraq. Plant Archives,
20(2), 926–929.
Amaral, C. E., Lima, L. C. & Dias, M. (2017). Pollen mor-
phology of Waltheria L. (Malvaceae-Byttnerioideae)
from Bahia, Brazil. Acta Botanica Brasilica, 31(4),
597–612.
Angiosperm Phylogeny Group (APG), Chase, M. W.,
Christenhusz, M. J., Fay, M. F., Byng, J. W., Judd,
W. S., Soltis, D. E., Mabberley, D. J., Sennikov, A.
N., Soltis, P. S., & Stevens, P. F. (2016). An update
of the Angiosperm Phylogeny Group classification
for the orders and families of flowering plants: APG
IV. Botanical Journal of the Linnean Society, 181(1),
1–20.
Antolinez, E. Y., Almanza, P. J., Barona, A. F., Polanco, E.,
& Serrano, P. A. (2020). Estado actual de la cacao-
cultura: una revisión de sus principales limitantes.
Revista Ciencia y Agricultura, 17(2), 1–11.
Aoun, M. (2017). Host defense mechanisms during fungal
pathogenesis and how these are overcome in suscepti-
ble plants: A review. International Journal of Botany,
13, 82–102.
Bayer, C., Fay, M. F., de Bruijn, A. Y., Savolainen, V., Mor-
ton, C. M., Kubitzki, K., Alverson, W., & Chase, M.
W. (1999). Support for an expanded family concept of
11
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
Malvaceae within a recircumscribed order Malvales:
A combined analysis of plastid atpB and rbcL DNA
sequences. Botanical Journal of the Linnean Society,
129(4), 267–303.
Bayer, C., & Kubitzki, K. (2003). Malvaceae. In K. Kubitz-
ki (Ed.), The families and genera of vascular plants
(pp. 225–31). Springer-Verlag.
Beg, M. S., Ahmad, S., Jan, K., & Bashir, K. (2017). Sta-
tus, supply chain and processing of cocoa-a review.
Trends in Food Science & Technology, 66, 108–116.
Bibi, N., Naveed, A., Manzoor, H., & Khan, M. A. (2010).
Systematic implications of pollen morphology in
the family Malvaceae from North West frontier pro-
vince, Pakistan. Pakistan Journal of Botany, 42(4),
2205–2214.
Blackmore, S., Wortley, A. H., Skvarla, J. J., & Rowley,
J. R. (2007). Pollen wall development in flowering
plants. New Phytologist, 174(3), 483–498.
Bhattacharjee, R. (2018). Taxonomy and classification of
cacao. In P. Umaharan (Ed.), Achieving sustainable
cultivation of cocoa (pp. 1–16). Burleigh Dodds
Science Publishing.
Brewbaker, J. (1967). The distribution and phylogenetic
significance of binucleate and trinucleate pollen gra-
ins in the angiosperms. American Journal of Botany,
54(9), 1069–1083.
Bridgemohan, P., Singh, K., Cazoe, E., Perry, G., Moha-
med, A., & Bridgemohan, R. (2017). Cocoa floral
phenology and pollination: Implications for producti-
vity in Caribbean Islands. Journal of Plant Breeding
and Crop Science, 9(7), 106–117.
Christensen, P. B. (1986). Pollen morphological studies in
Malvaceae. Grana, 25(2), 95–117.
Crang, R., Lyons-Sobaski, S., & Wise, R. (2018). Plant
Anatomy: A Concept-Based Approach to the Structure
of Seed Plants. Springer.
Demarco, D. (2017). Histochemical analysis of plant
secretory structures. In C. Pellicciari & M. Big-
giogera (Eds.), Histochemistry of Single Molecules
Methods and Protocols (Vol. 2566, pp. 291–310).
Humana Press.
de Jesus-Branco, S. M., da Silva, D. V., Lopes, U. V.,
& Corrêa, R. X. (2018). Characterization of the
sexual self-and cross-compatibility in genotypes of
cacao. American Journal of Plant Sciences, 9(9),
1794–1806.
Dias, M., & Ribeiro, F. D. (2015). Pollen morphology and
exine ultrastructure of selected species of Waltheria
L. (Byttnerioideae-Malvaceae). Review of Palaeobo-
tany and Palynology, 221, 204–210.
Fernández, J., Talle, B., & Wilson, Z. A. (2015). Anther
and pollen development: a conserved developmen-
tal pathway. Journal of Integrative Plant Biology,
57(11), 876–891.
Ford, C. S., & Wilkinson, M. J. (2012). Confocal observa-
tions of late-acting self-incompatibility in Theobroma
cacao L. Sexual Plant Reproduction, 25(3), 169–183.
Furness, C. A., Rudall, P. J., & Sampson, F. B. (2002). Evo-
lution of microsporogenesis in angiosperms. Interna-
tional Journal of Plant Sciences, 163(2), 235–260.
Furness, C. A., & Rudall, P. J. (2004). Pollen aperture
evolution-a crucial factor for eudicot success? Trends
in Plant Science, 9(3), 154–158.
Galati, B. G., & Rosenfeldt, S. (1998). The pollen develo-
pment in Ceiba insignis (Kunth) Gibbs and Semir ex
Chorisia speciosa St Hil. (Bombacaceae). Phytomor-
phology, 48(2), 121–129.
Galati, B. G., Monacci, F., Gotelli, M. M., & Rosenfeldt,
S. (2007). Pollen, tapetum and orbicule development
in Modiolastrum malvifolium (Malvaceae). Annals of
Botany, 99(4), 755–763.
Galati, B. G., Gotelli, M. M., Rosenfeldt, S., Torretta, J.
P., & Zarlavsky, G. (2011). Orbicules in relation to
the pollination modes. In B. J. Kaiser (Ed.), Pollen:
structure, y types and effects (pp. 1–15). Nova Scien-
ce Publisher.
García, T. B., de Vilhena, R. C., Souza T. Y., Demarco, D.,
& Andrade A. C. (2014). Leaf anatomical features of
three Theobroma species (Malvaceae sl) native to the
Brazilian Amazon. Acta Amazonica, 44(3), 291–300.
Halbritter, H. (2017). Guazuma ulmifolia. PalDat-A paly-
nological database. https://www.paldat.org/pub/
Guazuma_ulmifolia/302981
Halbritter, H., Ulrich, S., Grimsson, F., Weber, M., Zetter,
R., Hesse, M., Buchner, R., Svojtka, M., & Frosch-
Radivo, A. (2018). Illustrated pollen terminology (2nd
Ed.). Springer.
Hamdy, R., & Shamso, E. (2010). Pollen morphology of
Sterculiaceae (s. str.) in Egypt and its taxonomic sig-
nificance. Egyptian Journal of Botany, 50, 103–117.
Heslop-Harrison, J. (1966). Cytoplasmatic connections
during spore formation in flowering plants. Endea-
vour, 25, 65–72.
Heslop-Harrison, J. (1974). The physiology of the pollen
grain surface. Proceedings of the Royal Society of
London, 190(1100), 275–299.
Heslop-Harrison, Y., & Heslop-Harrison, J. (1982). The
microfibrillar component of the pollen intine some
structural features. Annals of Botany, 50(6), 831–842.
12 Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
Lanaud, C., Fouet, O., Legavre, T., Lopes, U., Sounigo, O.,
Eyango, M. C., Mermaz, B., Da Silva, M. R., Loor, R.
G., Argout, X., Gaypay, G., Ebaiarrey, H. E., Colon-
ges, K., Sanier, C., Rivallan, R., Mastin, G., Cryer,
N., Boccara, M., Verdeil, J. L, … Clément, D. (2017).
Deciphering the Theobroma cacao self-incompatibi-
lity system: from genomics to diagnostic markers for
self-compatibility. Journal of Experimental Botany,
68(17), 4775–4790.
Lattar, E. C., Galati, B. G., & Ferrucci, M. S. (2012).
Ultrastructural study of pollen and anther develop-
ment in Luehea divaricata (Malvaceae, Grewioideae)
and its systematic implications: Role of tapetal
transfer cells, orbicules and male germ unit. Flora-
Morphology, Distribution, Functional Ecology of
Plants, 207(12), 888–894.
Lattar, E. C., Galati, B. G., & Ferrucci, M. S. (2014).
Comparative study of anther development, micros-
porogenesis and microgametogenesis in species of
Corchorus, Heliocarpus, Luehea and Triumfetta
(Malvaceae: Grewioideae) from South America. New
Zealand Journal of Botany, 52(4), 429–445.
Lattanzio, V., Lattanzio, M. T. V., & Cardinali, A. (2006).
Role of phenolics in the resistance mechanisms
of plants against fungal pathogens and insects. In
F. Imperato (Ed.), Phytochemistry: Advances in
Research (pp. 23–67). Research Signpost.
López, J. G., López, L. E., Avendaño, C. H., Aguirre, J. F.,
Espinosa, S., Moreno, J. L., Mendoza, A., & Suárez,
V. G. M. (2018). Biología floral de cacao (Theobroma
cacao L.); criollo, trinitario y forastero en México.
Agroproductividad, 11(9), 129–136.
Nadot, S., Furness, C. A., Sannier, J., Penet, L., Triki‐Teur-
troy, S., Albert, B., & Ressayre, A. (2008). Phyloge-
netic comparative analysis of microsporogenesis in
angiosperms with a focus on monocots. American
Journal of Botany, 95(11), 1426–1436.
Narayanapur, V. B., Suma, B., & Minimol, J. S. (2018).
Self-incompatibility: a pollination control mechanism
in plants. International Journal of Plant Sciences
(Muzaffarnagar), 13(1), 201–212.
N’Zi, J. C., Kahia, J., Diby, L., & Kouamé, C. (2017).
Compatibility of ten elite cocoa (Theobroma cacao
L.) clones. Horticulturae, 3(3), 45.
Osorio, J. A., Berdugo, J., Coronado, R. A., Zapata, Y. P.,
Quintero, C., Gallego, G., & Yockteng, R. (2017).
Colombia a source of cacao genetic diversity as
revealed by the population structure analysis of germ-
plasm bank of Theobroma cacao L. Frontiers in Plant
Science, 8, 1994.
Pacini, E. (2010). Relationships between tapetum, loculus,
and pollen during development. International Journal
of Plant Sciences, 171(1), 1–11.
Pacini, E., & Hesse, M. (2012). Uncommon pollen walls:
reasons and consequences. Verhandlungen der Zoo-
logisch-Botanischen Gesellschaft in Osterreich, 148,
291–306.
Perveen, A., & Qaiser, M. (2009). Pollen flora of Pakistan-
Malvaceae: Dombeyoideae-Lxii. Pakistan Journal of
Botany, 41(2), 491–494.
Prieu, C., Toghranegar, Z., Gouyon, P. H., & Albert, B.
(2019). Microsporogenesis in angiosperms producing
pantoporate pollen. Botany Letters, 166(4), 457–466.
Punt, W., Hoen, P. P., Blackmore, S., Nilsson, S., & Le
Thomas, A. (2007). Glossary of pollen and spore
terminology. Review of Palaeobotany and Palynology,
143(1-2), 1–81.
Ramming, D. W., Hinrichs, H. A., & Richardson, P. E.
(1973). Sequential staining of callose by aniline blue
and lacmoid for fluorescence and regular microscopy
on a durable preparation of the same specimen. Stain
Technology, 48(3), 133–134.
Rangel, M. A., Zavaleta, H. A., Córdova, L., López, A. P.,
Delgado, A., Vidales, I., & Villegas, Á. (2012). Ana-
tomía e histoquímica de la semilla del cacao (Theo-
broma cacao L.) criollo mexicano. Revista Fitotecnia
Mexicana, 35(3), 189–197.
Richardson, J. E., Whitlock, B. A., Meerow, A. W., &
Madriñán, S. (2015). The age of chocolate: a diver-
sification history of Theobroma and Malvaceae.
Frontiers in Ecology and Evolution, 3, 120.
Rincón-Barón, E. J., Grisales, E. C., Cuaran, V. L., &
Cardona, N. L. (2020). Alteraciones anatómicas e
histoquímicas ocasionadas por la oidiosis en hojas de
Hydrangea macrophylla (Hydrangeaceae). Revista de
Biología Tropical, 68(3), 959–976.
Rincón-Barón, E. J., Zarate, D. A., Castañeda, G. A. A.,
Cuarán, V. L., & Passarelli, L. M. (2021a). Micromor-
fología y ultraestructura de las anteras y los granos
de polen en diez genotipos élite de Theobroma cacao
(Malvaceae). Revista de Biología Tropical, 69(2),
403–421.
Rincón-Barón, E. J., Torres-Rodríguez, G. A., Passarelli, L.
M., Zárate, D. A., Cuarán, V. L., & Plata-Arboleda, S.
(2021b). Microsporogénesis y micromorfología del
polen de la planta Alcea rosea (Malvaceae). Revista
de Biología Tropical, 69(3), 852–864.
Ruggiero, F., & Bedini, G. (2020). Phylogenetic and mor-
phologic survey of orbicules in angiosperms. Taxon,
69(3), 543–566.
Ruzin, S. E. (1999). Plant microtechnique and microscopy.
Oxford University.
Sánchez, V., Zambrano, J. L., Iglesias, C., Rodríguez, E.,
Villalobos, V., Díaz, F. J., Carrillo, N., Gutiérrez, A.,
Camacho, A., & Rodríguez, O. (2019). La cadena
13
Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 71: e51101, enero-diciembre 2023 (Publicado Mar. 03, 2023)
de valor del cacao en América Latina y el Caribe.
FONTAGRO, ESPOL, INIAP.
Scott, R. J., Spielman, M., & Dickinson, H. G. (2004). Sta-
men structure and function. The Plant Cell, 16(S1),
S46–S60.
Squicciarini, M. P., & Swinnen, J. (2016). The Economics
of Chocolate. Oxford University Press.
Sivachandran, R., Gnanam, R., Sudhakar, D., Suresh,
J., & Ganesh, S. (2017). Influence of genotypes,
stages of microspore, pre-treatments and media fac-
tors on induction of callus from anthers of cocoa
(Theobroma cacao L.). Journal of Plantation Crops,
45(3),162–172.
Soukup, A. (2014). Selected simple methods of plant cell
wall histochemistry and staining for light micros-
copy. In V. Žárský, & F. Cvr‐ková (Eds.), Plant cell
morphogenesis: methods and protocols, methods in
molecular biology (pp. 25–40). Humana Press.
Strittmatter, L. I, Galati, B. G., & Monacci, F. (2000).
Ubisch bodies in the peritapetal membrane of Abu-
tilon pictum Gill (Malvaceae). Beiträge zur Biologie
der Pflanzen, 71, 1–10.
Strittmatter, L. I., & Galati, B. G. (2001). Development of
anthers, microsporogenesis and microgametogenesis
of Myosotis azorica and M. laxa (Boraginaceae).
Phytomorphology, 51(1), 1–10.
Swanson, J. D., Carlson, J. E., & Guiltinan, M. J. (2008).
Comparative flower development in Theobroma
cacao based on temporal morphological indicators.
International Journal of Plant Sciences, 169(9),
1187–1199.
Tang, Y. A., Gao, H., Wang, C. M., & Chen, J. Z.
(2006). Microsporogenesis and microgametogenesis
of Excentrodendron hsienmu (Malvaceae sl) and their
systematic implications. Botanical Journal of the
Linnean Society, 150(4), 447–457.
Tang, Y. A., Gao, H., & Xie, J. Z. (2009). An embryological
study of Eriolaena candollei
Wallich (Malvaceae) and its systematic implications. Flora,
204(8), 569–580.
Varela, M. C., Arslan, I., Reginato, M. A., Cenzano, A.
M., & Luna, M. V. (2016). Phenolic compounds as
indicators of drought resistance in shrubs from Pata-
gonian shrublands (Argentina). Plant Physiology and
Biochemistry, 104, 81–91.
Venancio, A. C., de Souza, N. C., Dias, M., & Gasparino,
E. C. (2022). Pollen morphology of Malvaceae s.l.
from Cerrado Forest Fragments: details of aperture
and ornamentation in the pollen types definition.
Palynology, 46(1), 1–15.
Verstraete, B., Moon, H. K., Smets, E., & Huysmans, S.
(2014). Orbicules in flowering plants: a phylogenetic
perspective on their form and function. The Botanical
Review, 80, 107–134.
von Balthazar, M., Schönenberger, J., Alverson, W. S.,
Janka, H., Bayer, C., & Baum, D. A. (2006). Structure
and evolution of the androecium in the Malvatheca
clade (Malvaceae sl) and implications for Malvaceae
and Malvales. Plant Systematics and Evolution, 260,
171–197.
Wickramasuriya, A. M., & Dunwell, J. M. (2018). Cacao
biotechnology: current status and future prospects.
Plant Biotechnology Journal, 16(1), 4–17.
Young, A. M., Erickson, E. H., Strand, M. A., & Erickson,
B. J. (1987). Pollination biology of Theobroma and
Herrania (Sterculiaceae)—I. Floral biology. Inter-
national Journal of Tropical Insect Science, 8(2),
151–164.
