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Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 72: e54500, enero-diciembre 2024 (Publicado Ene. 19, 2024)
Influencia de la edad en el contenido de fenoles
y ligninas en Gmelina arborea (Lamiaceae)
Bernal Azofeifa Bolaños1*; https://orcid.org/0000-0002-8902-0352
Víctor Álvarez Valverde2; https://orcid.org/0000-0001-6007-9150
Ashly Olivares Madriz2; https://orcid.org/0009-0006-3604-2810
Mariana Pineda Cascante2; https://orcid.org/0009-0009-1794-4386
Daniela Campos Salas2; https://orcid.org/0009-0001-8465-5762
Ana Hine Gómez1; https://orcid.org/0000-0002-7226-2275
1. Instituto de Investigación y Servicios Forestales, Universidad Nacional, 86-3000, Heredia, Costa Rica;
bernal.azofeifa.bolanos@una.cr (*Correspondencia), ana.hine.gomez@una.cr
2. Laboratorio de Fitoquímica, Universidad Nacional, 86-3000, Heredia, Costa Rica; victor.alvarez.valverde@una.cr,
ashly.olivares.madriz@est.una.ac.cr, mariana.pineda.cascante@est.una.ac.cr, daniela.campos.salas@est.una.ac.cr
Recibido 15-V-2023. Corregido 06-XI-2023. Aceptado 08-I-2024.
ABSTRACT
The influence of age on the phenolic contents and lignins of Gmelina arborea (Lamiaceae)
Introduction: Melina (Gmelina arborea) is a tree species of great interest for its wood and medicinal properties.
In Costa Rica, there are genetically superior clones that are propagated without knowledge of the ontogenic and
physiological age of the materials.
Objective: To evaluate how age influences the content of phenols and lignins in leaves, petioles, stems, and roots
of melina plants.
Methods: The total phenolic and lignins contents were determined using Folin-Ciocalteu colorimetric method
and alkaline extraction method, respectively. Plants of five different ages were chosen for the investigation (in
vitro plants “year 0” and trees of a year and a half, four, seven and 20 years). Sampling was done in March and
April 2021.
Results: All parts of the plant analyzed contain phenolic compounds and lignins, regardless of their age. There
was no positive correlation between age and phenol and lignin content for any development condition, since the
highest values were not obtained in the oldest trees. Leaf extracts from in vitro plants and seven-year-old trees
showed, respectively, the highest phenol and lignin contents for all conditions (P < 0.05). The lowest average
values of phenolic compounds for all conditions were obtained in four-year-old trees. Regarding lignins, the
lowest content occurred in the oldest roots, although the trend was not maintained for the rest of the plant parts.
Conclusions: This study provides the first results of the content of phenolic compounds and lignins present
in different tissues of a forest species of different ages. Therefore, they are the first reference values about the
biochemical commitment for phenolic synthesis according to the age and the specific developmental stage of a
woody plant.
Key words: reinvigoration; secondary metabolites; ontogeny; photomorphogenesis; heterotrophy.
https://doi.org/10.15517/rev.biol.trop..v72i1.54500
BOTÁNICA Y MICOLOGÍA
2Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 72: e54500, enero-diciembre 2024 (Publicado Ene. 19, 2024)
INTRODUCCIÓN
Gmelina arborea Roxb. ex Sm. es un árbol
maderable de la familia Lamiaceae. Su distri-
bución natural comprende países como India,
Bangladesh, Sri Lanka, Myanmar, Tailandia,
China, Laos, Camboya e Indonesia. Debido a
su importancia en la industria forestal y medi-
cinal, la melina se cultivó en muchas regiones
tropicales de países de Latinoamérica como
Brasil, Costa Rica, Honduras, Panamá, Vene-
zuela, México y Colombia (Warrier et al., 2021).
En las regiones tropicales de América,
Costa Rica es el país con mayor experiencia
en la selección y mejoramiento genético de G.
arborea. Desde las primeras plantaciones esta-
blecidas en la década del sesenta para la selec-
ción fenotípica de características comerciales, el
establecimiento posterior de rodales y huertos
semilleros para la venta de semilla seleccionada,
hasta la obtención de clones de árboles “plus”,
la investigación y desarrollo en melina se ha
convertido en un eje de vanguardia dentro del
sector forestal (Araya, 2005; Ávila-Arias et al.,
2016; Dvorak, 2004; Morales, 2004).
La melina es la segunda especie más culti-
vada desde el 2004 en Costa Rica y es la especie
forestal que produce más tarimas para el emba-
laje de los principales productos de exportación
del país (ONF, 2022). A pesar de ello, desde el
2015 hay una tendencia de reducción sistemáti-
ca de plantaciones de alta calidad. Las variacio-
nes intraespecíficas inter e intrapoblacionales
en cuanto a la densidad de la madera generan
una crisis de renovación sustentable (Ávila-
Arias et al., 2015; Dvorak, 2004) y una menor
expectativa para el uso de la madera en merca-
dos más especializados del sector construcción,
exportación o mueblería.
En la actualidad, existe una necesidad por
conocer la edad ontogenética de los clones
de melina de alto valor comercial, pues la
capacidad de multiplicación disminuye cuan-
do la propagación se realiza a partir de seg-
mentos de plantas maduras. Está ampliamente
documentado que las tecnologías y estrate-
gias empleadas en el cultivo in vitro permiten
el rejuvenecimiento de materiales fisiológica-
mente maduros (Read & Bavougian, 2013).
Generalmente, las estrategias morfológicas para
RESUMEN
Introducción: La melina (Gmelina arborea), es una especie de gran interés por su madera y propiedades medi-
cinales. En Costa Rica, existen clones genéticamente superiores que se propagan sin el conocimiento de la edad
ontogénica y fisiológica de los materiales.
Objetivo: Evaluar la relación del contenido de fenoles y ligninas en hojas, peciolos, tallos y raíces de plantas con
diferentes edades.
Métodos: Los contenidos de fenoles y ligninas totales se determinaron mediante el método colorimétrico de
Folin-Ciocalteu y el método de extracción alcalina, respectivamente. Para la investigación se eligieron plantas in
vitro “año cero” y árboles de año y medio, cuatro, siete y 20 años. El muestreo se realizó en marzo y abril del 2021.
Resultados: Se demostró que todas las partes de la planta analizadas contienen compuestos fenólicos y ligninas,
independientemente de su edad. No hubo una correlación positiva entre la edad con el contenido de fenoles y
ligninas para ninguna condición de desarrollo, pues los valores más altos no se obtuvieron en los árboles más
longevos. Los extractos de hojas de las plantas in vitro y los árboles de siete años mostraron, respectivamente, los
contenidos más altos de fenoles y ligninas para todas las condiciones (P < 0.05). Los valores promedio más bajos
de compuestos fenólicos para todas las condiciones se obtuvieron en los árboles de cuatro años. Respecto a las
ligninas, el contenido más bajo se presentó en las raíces más longevas, aunque la tendencia no se mantuvo para
el resto de las partes de la planta.
Conclusiones: La investigación muestra los primeros resultados del contenido de compuestos fenólicos y ligninas
presentes en diferentes tejidos de una especie forestal de edades diferentes. Por lo tanto, son los primeros valores
de referencia acerca del compromiso bioquímico para la síntesis fenólica según la edad y el estado de desarrollo
específico de una planta leñosa.
Palabras clave: revigorización; metabolitos secundarios; ontogenia; fotomorfogénesis; heterotrofia.
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identificar cambios de desarrollo atribuidos
a la ontogenia necesitan el valor potencial de
respuesta en la madurez. Evidentemente, en
plantas leñosas se necesitan herramientas más
rápidas y confiables para evaluar los estados
de desarrollo. Fernandez-Lorenzo et al. (1999),
caracterizaron estadios juveniles y adultos de
árboles con el análisis cromatográfico y espec-
trofotométrico de polifenoles con relativa rapi-
dez y sencillez.
Los compuestos fenólicos, incluidas las
ligninas, están presentes en todas las plan-
tas superiores y cumplen diversas funciones
durante el crecimiento y desarrollo de las plan-
tas. Los cambios en los contenidos de estos
compuestos están relacionados con el estado
de diferenciación (Amoo et al., 2012; Rencoret
et al., 2011), control genético, las condiciones
ambientales (Covelo & Gallardo, 2001) y la
capacidad de secuestrar especies reactivas de
oxígeno (ERO) en presencia de factores de
estrés (Liu et al., 2018). Por lo tanto, además de
su función como marcador bioquímico de la
edad, la concentración de fenoles en los tejidos
vegetales es un buen indicador para predecir
el grado de tolerancia al estrés en las plantas
(Sharma et al., 2019).
Es difícil determinar los patrones de sín-
tesis de metabolitos secundarios en plantas,
incluidos los compuestos fenólicos, pues existen
factores genéticos, ontogenéticos, morfogenéti-
cos y ambientales que ocasionan fluctuaciones
en los contenidos. En este sentido, Pérez-Ochoa
et al. (2022) mencionan que los fenoles, fla-
vonoides y terpenos cambian con la edad de
la planta y que en algunos casos los conteni-
dos aumentan en dependencia de los estados
generativos (floración/fructificación) en com-
paración con los estados vegetativos. Por esos
motivos, no sólo es importante determinar el
contenido total de los metabolitos secundarios,
sino también, su composición en cada etapa de
desarrollo (Koricheva & Barton, 2012).
Meta análisis de las investigaciones que
han evaluado los cambios en la producción de
metabolitos secundarios en plantas relaciona-
dos con la ontogenia y la estacionalidad, reve-
laron que las concentraciones constitutivas de
todos los tipos de estos compuestos aumentan
significativamente desde la etapa de plántula
hasta la madurez, tanto en plantas herbáceas
como leñosas (Koricheva & Barton, 2012).
En relación con los cambios ontogenéticos en
la inducción de metabolitos secundarios por
herbivoría, la mayoría de los estudios se han
realizado en hierbas juveniles y plantas herbá-
ceas; éstas han mostrado un aumento significa-
tivo en comparación con las plantas maduras.
Según los mismos autores, el único estudio que
investigó la relación entre la edad ontogenética
y la inducción de metabolitos secundarios por
herbivoría en plantas leñosas demostró que las
plantas maduras acumulan más metabolitos
que las juveniles.
En especies leñosas, se han propuesto
varias hipótesis para predecir los efectos del
ambiente y la disponibilidad de recursos en la
regulación y producción de metabolitos secun-
darios. Las dos hipótesis más aceptadas: equi-
librio carbono-nutriente (ECN) y equilibrio
crecimiento-diferenciación (CD) (Covelo &
Gallardo, 2001) no predicen la asignación de
carbono durante la fotosíntesis (nivel de jerar-
quía bajo), debido a que la proporción asignada
para el metabolismo secundario está en función
del excedente producido en niveles de jerarquía
altos (Koricheva et al., 1998). Por su parte, el
modelo de competencia proteica basado en los
controles de la biosíntesis de proteínas y fenoles
se basa en los orígenes metabólicos de la ruta
que regula el flujo de carbono y la asignación de
componentes secundarios basados en carbono,
los destinos alternativos de los precursores de
la ruta y los mecanismos reguladores bioquí-
micos, por lo cual, se considera el modelo más
adecuado para predecir la asignación de fenoles
foliares en plantas superiores terrestres (Jones
& Hartley, 1999).
Aunque las plantas de forma natural pro-
ducen compuestos fenólicos, la evaluación de
la expresión en ambientes in vitro dependerá
de los factores ambientales presentes en con-
diciones heterótrofas. Debido a la breve fase
estacionaria de las plantas cultivadas in vitro,
la producción de metabolitos secundarios pre-
senta muy bajos rendimientos, por ejemplo:
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se inhibe la acción enzimática normalmente
presente en plantas maduras (Dias et al., 2016).
No obstante, existen numerosos estudios donde
se obtienen compuestos fenólicos a través del
cultivo in vitro al mantener la capacidad de
sintetizar compuestos de plantas ex vitro. Sin
embargo, según Dubravina et al. (2005), en la
mayoría de los casos el nivel de acumulación
de estos compuestos es menor en comparación
con plantas ex vitro, aparentemente por la acu-
mulación de cambios genéticos y bioquímicos
en las células de los cultivos in vitro.
Durante el cultivo in vitro, debido al con-
trol estricto de los ambientes fisicoquímicos,
se eliminan presiones externas como cambios
drásticos de luz, temperatura, humedad, herbi-
voría, competencia por nutrientes, entre otros;
motivo por el cual, se esperan niveles bajos de
expresión de compuestos fenólicos debido a la
poca o nula variación de los agentes que oca-
sionan estrés oxidativo. Sin embargo, esta hipó-
tesis no se ha evaluado en melina y es de suma
importancia la generación de información para
determinar si el cultivo de tejidos puede ocasio-
nar o no un estrés oxidativo que pueda ocasio-
nar problemas durante la revigorización de las
plantas en comparación con plantas ex vitro de
diferentes edades.
Por lo tanto, el objetivo de la investigación
fue evaluar cómo influye la edad en el conteni-
do de fenoles y ligninas en hojas, pecíolos, tallos
y raíces de clones de G. arborea. Los resultados
obtenidos en esta investigación representan el
primer trabajo en melina que informa acerca
de los contenidos de metabolitos secundarios
como marcadores de la ontogenia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal: Los experimentos se rea-
lizaron en el Laboratorio de Fitoquímica de
la Universidad Nacional (LAFIT-UNA). Las
muestras vegetales de año y medio, cuatro, siete
y 20 años usadas en este estudio se obtuvie-
ron de plantaciones de melina ubicadas en el
Centro Agronómico Tropical de Investigación
y Enseñanza (CATIE) (coordenadas geográ-
ficas aproximadas 9°53’32.2” N & 83°39’4.4”
W). Las vitroplantas provenientes de la fase
de multiplicación se obtuvieron del proyecto
¨Biofábrica para el rejuvenecimiento y repro-
ducción masiva de material seleccionado de
Melina (Gmelina arborea Roxb.) para el sector
forestal costarricense (0576-19)¨, adscrito al
Instituto de Investigación y Servicios Forestales
de la UNA (INISEFOR-UNA). El muestreo
de las plantas ex vitro fue realizado los meses
de marzo y abril del 2021. Las muestras de
hojas compuestas se transportaron en nitró-
geno líquido hasta el laboratorio donde fue-
ron liofilizadas durante 24 h y posteriormente
almacenadas en congelación (-20 °C).
Extracción de fenoles: Para el proceso de
extracción y cuantificación de fenoles se utilizó
la metodología propuesta por Gurr et al. (1992).
Las hojas liofilizadas se molieron y se tamiza-
ron hasta obtener tamaños de partícula meno-
res a 1 mm. Se pesaron 75 mg de muestras secas
y se depositaron en viales de rosca cilíndricos.
A cada muestra se le agregó 3 ml de metanol.
La mezcla se agitó vigorosamente durante 5 s
antes de realizar un baño por sonicación a 40
°C durante 5 min. Los tubos se centrifugaron a
3 500 rpm durante 5 min. El procedimiento se
repitió tres veces y se aforó con el mismo disol-
vente a 10 ml de extracto.
Cuantificación de fenoles: La cuantifica-
ción de los fenoles se realizó por triplicado en
un lector de microplacas (BioTek Synergy™ HT,
California, USA) para microplaca de 96 poci-
llos se evaluó la absorbancia de las muestras. A
30 µl del extracto se le agregaron 200 µl de agua
destilada y 15 µl de reactivo de Folin-Ciocalteu.
Posteriormente, se le adicionaron 50 µl de
Na2CO3 15 %. Las absorbancias se midieron a
una longitud de onda de 755 nm. El contenido
de compuestos fenólicos solubles se expresó
como los miligramos equivalentes de ácido
gálico por gramo de muestra seca (mg EAG *
g-1 MS).
Extracción de ligninas: Para la extracción
y cuantificación de las ligninas se utilizó la
metodología de Stafford (1960). Se tomaron
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75 mg de muestras secas sin clorofila y se depo-
sitaron en viales de rosca cilíndricos. La pri-
mera extracción se realizó con 2 ml de dietil
éter durante dos min para luego centrifugar a
2 000 g por 5 min. El sobrenadante se decantó
y el precipitado se lavó con 5 ml de agua desti-
lada. Se volvió a centrifugar y nuevamente se
descartó el sobrenadante. Este procedimiento
se realizó por duplicado. Luego, se realizó una
extracción alcalina al precipitado con 2 ml de
NaOH 0.5N entre 70-80 °C por 14 h. Poste-
riormente, en frío, se agregó 100 µl de HCI 2N
y se ajustó el pH a 7 o 8 con NaOH. Una vez
ajustado el pH se aforó a un volumen de 3 ml
con agua destilada. La mezcla se centrifugó a 2
000 g por 5 min y se colectó el sobrenadante. A
2 ml del extracto se le agregó 2 ml de tampón
de fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.0. A la otra
alícuota de los 2 ml del extracto se le agregó
2 ml de NaOH 0.1N (pH 12.3). Finalmente,
se midió la absorbancia a 245 y 350 nm en un
espectrofotómetro (Thermo Fisher, Evolution™
350 UV-VIS, Massachusetts, USA).
Cuantificación de ligninas: El conteni-
do total de ligninas se calculó de la siguiente
manera:
Ligninas = (Abs pH7 245 nm -
Abs pH12 350 nm) / E. guaiacol * FG *
MM guaiacol * FD * VB/m
Donde:
E. guaiacol (absortividad molar) = 4 100
FG = 1000 (g a mg)
MM guaiacol (masa molecular) = 124.14 g/mol
FD (factor de dilución)
VB (volumen de balón)
m (masa en gramos)
El contenido de ligninas se expresó como
los miligramos equivalentes de lignina por
gramo de muestra seca (mg lignina * g-1 MS).
Todas las mediciones se realizaron por
triplicado y todos los datos se expresaron como
valores promedio ± desviación estándar.
Todos los análisis estadísticos se realiza-
ron con el software estadístico R 3.5.1 (R Core
Team, 2019). Las comparaciones múltiples de
los valores medios de los contenidos fenólicos
y de ligninas se realizaron con el paquete Mult-
comp en R (Hothorn et al., 2008).
RESULTADOS
La presente investigación describe los
resultados del contenido de fenoles totales
solubles (FTS) y ligninas presentes en hojas,
peciolos, tallos y raíces de clones de melina
de cinco edades diferentes: plantas in vitro y
plantas de año y medio, cuatro, siete y 20 años.
Se demostró que todas las partes de la planta
analizadas contienen compuestos fenólicos y
ligninas independientemente de su edad.
En términos generales, los extractos de
hojas tienen un contenido mayor de FTS y de
ligninas en comparación con los extractos de
peciolos, tallos y raíces para todas las edades
(Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4).
Los extractos obtenidos de las plantas in
vitro presentaron las mayores concentraciones
de FTS, con excepción de los extractos fenó-
licos obtenidos de los tallos de los árboles de
año y medio y los mayores a 20 años, donde se
presentaron valores promedio más altos, pero
sin diferencias estadísticamente significativas
(P > 0.05) (Fig. 3). En todos los casos, los valo-
res promedio más bajos se obtuvieron en los
árboles de cuatro años. Independientemente de
la edad, los extractos de todas las partes de las
plantas incrementan el contenido de FTS sin
llegar a los valores obtenidos por las plantas in
vitro. Sin embargo, el patrón de respuesta del
contenido fenólico varía entre las diferentes
partes de la planta una vez alcanzado los siete
años. En cuanto a las hojas, la concentración
promedio obtenida para los árboles de siete
y 20 años fue de 40 ± 1 μg EAG/ g MS (P <
0.05) (Fig. 1). Tendencia similar se presentó
en las raíces con valores promedio de 16 ± 0.6
μg EAG/ g MS (P < 0.05) (Fig. 4). No obstan-
te, para estas mismas edades los extractos de
peciolos y tallos muestran un contenido de
fenoles con una tendencia descendente (de
13 ± 0.6 a 9 ± 0.6 μg EAG/ g MS; P < 0.05) y
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ascendente (de 9 ± 0.1 a 13 ± 0.5 μg EAG/ g MS;
P < 0.05), respectivamente (Fig. 1, Fig. 2).
En relación con las ligninas, los extractos
foliares obtuvieron los mayores contenidos en
comparación con todas las partes de la planta,
independientemente de la edad. Los extractos
de hojas, y en menor medida los extractos
de los peciolos mostraron una relación de U
invertida (Fig. 1, Fig. 2). En el caso de las hojas,
las plantas más jóvenes presentaron los valores
Fig. 1. Concentración de fenoles totales solubles y ligninas en hojas de Gmelina arborea en función de su edad. MS:
muestra seca. EAG: equivalentes de ácido gálico. Letras minúsculas y mayúsculas diferentes significan que hay diferencias
significativas (P < 0.05) entre los contenidos de fenoles y ligninas, respectivamente. / Fig. 1. Concentration of total soluble
phenols and lignins in leaves of Gmelina arborea as a function of age. DM: dry sample. EAG: gallic acid equivalents. Different
lowercase and uppercase letters mean that there are significant differences (P < 0.05) between phenol and lignin contents,
respectively.
Fig. 2. Concentración de fenoles totales solubles y ligninas en peciolos de Gmelina arborea en función de su edad. MS:
muestra seca. EAG: equivalentes de ácido gálico. Letras minúsculas y mayúsculas diferentes significan que hay diferencias
significativas (P < 0.05) entre los contenidos de fenoles y ligninas, respectivamente. / Fig. 2. Concentration of total soluble
phenols and lignins in petioles of Gmelina arborea as a function of age. DM: dry sample. EAG: gallic acid equivalents.
Different lowercase and uppercase letters mean that there are significant differences (P < 0.05) between phenol and lignin
contents, respectively.
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promedio más bajos (768 mg ± 49 lignina g-1
MS), aunque estadísticamente no significativos
con los árboles de año y medio; siete y 20 años
(P > 0.05). La mayor concentración de ligninas
(1126 ± 42 mg lignina g-1 MS) se obtuvo a los
siete años (P < 0.05), después de lo cual, las
plantas más longevas disminuyeron el conteni-
do fenólico a valores similares a las plantas in
vitro (805 ± 21 mg lignina g-1 MS) (Fig. 1).
En el caso de los peciolos, el patrón de res-
puesta fue muy similar a las hojas, con los pro-
medios significativamente más bajos para las
plantas in vitro (155 ± 14 mg lignina g-1 MS) y
los más altos para las plantas de siete años (332
± 22 mg lignina g-1 MS; P < 0.05). No obstante,
la disminución observada de las ligninas en
los árboles más viejos fue menos pronunciada
que en las hojas, pues la diferencia promedio
Fig. 3. Concentración de fenoles totales solubles y ligninas en tallos de Gmelina arborea en función de su edad. MS:
muestra seca. EAG: equivalentes de ácido gálico. Letras minúsculas y mayúsculas diferentes significan que hay diferencias
significativas (P < 0.05) entre los contenidos de fenoles y ligninas, respectivamente. / Fig. 3. Concentration of total soluble
phenols and lignins in Gmelina arborea stems as a function of age. DM: dry sample. EAG: gallic acid equivalents. Different
lowercase and uppercase letters mean that there are significant differences (P < 0.05) between phenol and lignin contents,
respectively.
Fig. 4. Concentración de fenoles totales solubles y ligninas en raíces de Gmelina arborea en función de su edad. MS:
muestra seca. EAG: equivalentes de ácido gálico. Letras minúsculas y mayúsculas diferentes significan que hay diferencias
significativas (P < 0.05) entre los contenidos de fenoles y ligninas, respectivamente. / Fig. 4. Concentration of total soluble
phenols and lignins in roots of Gmelina arborea as a function of age. DM: dry sample. EAG: gallic acid equivalents. Different
lowercase and uppercase letters mean that there are significant differences (P < 0.05) between phenol and lignin contents,
respectively.
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en comparación con los árboles de siete años
no fue significativa, pero con las plantas más
jóvenes la diferencia fue el doble (de 155 ± 14 a
303 ± 7mg lignina g-1 MS; P < 0.05).
Los patrones observados de los contenidos
de ligninas obtenidos en tallos y raíces fueron
muy similares. Las plantas in vitro obtuvieron
los extractos con los mayores contenidos (288
± 27 y 278 ± 79 mg lignina g-1 MS, respectiva-
mente). Los valores promedio más bajos de la
investigación se obtuvieron en los tallos de los
árboles de año y medio (141 ± 12 mg lignina
g-1 MS), aunque las diferencias no fueron signi-
ficativas con los árboles de siete y 20 años. Las
raíces de los árboles más longevos presentaron
los contenidos de lignina más bajos (120 ± 5
mg lignina g-1 MS), pero estadísticamente sólo
tuvo diferencias significativas con las plantas in
vitro. A los cuatro años, los tallos y las raíces
aumentaron el contenido de las ligninas, pero
el incremento solo fue significativo en los tallos
(224 ± 40 y 218 ± 25 mg lignina g-1 MS, res-
pectivamente). La tendencia en el contenido de
ligninas disminuye conforme el árbol aumenta
la edad. En el caso de los tallos de los árboles de
siete y 20 años, los valores promedio fueron 151
± 13 y 149 ± 9 mg lignina g-1 MS, mientras en
las raíces la reducción fue de 167 ± 4 a 120 ± 5
mg lignina g-1 MS, respectivamente (P > 0.05).
DISCUSIÓN
Los resultados muestran la evaluación de
un único periodo del ciclo de vida de un con-
junto de plantas de diferentes edades. En plan-
tas longevas, como los árboles, se puede tener
un gradiente complejo de tejidos en diferentes
etapas ontogenéticas de desarrollo (Koricheva
& Barton, 2012). Por tanto, las diferencias en los
contenidos de fenoles entre los segmentos eva-
luados de las plantas in vitro e in vivo se deben
a las diferentes condiciones de crecimiento y
etapas específicas del desarrollo de la planta.
Es importante destacar que los estudios
de largo plazo acerca de la distribución de los
metabolitos secundarios en plantas son escasos,
y según Wam et al. (2017), los patrones son
inconsistentes y poco claros. La mayoría de los
estudios acerca de la inducción de metabolitos
secundarios en plantas leñosas se llevan a cabo
en plántulas, probablemente por razones prác-
ticas, lo cual limita los datos para los estados
maduros (Koricheva & Barton, 2012).
La información en la literatura en rela-
ción con la presencia de fenoles y ligninas en
dependencia de las etapas de desarrollo es
contradictoria. Aunque existen investigaciones
que concluyen que las plantas in vitro presen-
tan menores rendimientos en la producción de
metabolitos secundarios en comparación con
las plantas de campo (Dias et al., 2016; Dubra-
vina et al., 2005), muchos estudios han demos-
trado que las condiciones específicas de la
micropropagación estimulan la producción de
compuestos fenólicos al modificar el metabolis-
mo primario. Particularmente, los nutrientes y
las hormonas influyen en la expresión de genes
implicados en la biosíntesis de metabolitos
secundarios (Debnath & Goyali, 2020; Gupta et
al., 2017; Liu et al., 2018). Incluso, hay evidencia
de una mejora en los metabolitos secundarios
de materiales micropropagados de plantas, teji-
dos o células en comparación con las plantas
cultivadas en el campo (Gupta et al., 2017).
Según Isah et al. (2018), los bajos rendi-
mientos obtenidos de metabolitos secundarios
en condición in vitro es por la alta utilización
del carbono exógeno del medio de cultivo
para el metabolismo primario. La demanda
total de proteínas en condiciones no in vitro, y
por tanto, su síntesis, está relacionada con las
demandas proteicas vinculadas al crecimiento,
fijación de carbono y homeóstasis (Jones &
Hartley, 1999). Pero, en condiciones in vitro, el
crecimiento y fijación de carbono no ocurre por
fotosíntesis, sino a través de fotomorfogénesis,
un proceso de desarrollo heterotrófico mediado
por luz y fuentes de carbono exógenas.
Según el modelo de competición proteica
propuesto por Jones y Hartley en 1999, existe
una disputa bioquímica por la fenilalanina,
que es la molécula precursora de la síntesis
de proteínas y fenoles. La hipótesis postula
que cuando las tasas de síntesis proteicas son
altas, las tasas de síntesis fenólicas deben ser
bajas y viceversa. En condiciones naturales, las
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Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 72: e54500, enero-diciembre 2024 (Publicado Ene. 19, 2024)
concentraciones de fenoles tienden a ser bajas
durante la fase de desarrollo juvenil porque las
demandas de proteínas totales son más altas
durante estos periodos (Koricheva & Barton,
2012). De la misma forma, en condiciones de
laboratorio no se esperan altas concentracio-
nes porque la acumulación in vitro de grandes
cantidades de metabolitos secundarios requiere
un nivel específico de diferenciación celular
(Amoo et al., 2012). La mayor cantidad de
fenoles obtenidos en esta investigación para la
condición in vitro (Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4),
aún en condiciones con gran cantidad de saca-
rosa, reflejan inconsistencias en relación con
la competencia entre proteínas y fenoles por la
utilización de fenilalanina para sus respectivas
síntesis.
Aun así, la investigación considera que el
modelo de competición proteico puede expli-
car los resultados obtenidos, lo cual se con-
firma con los estudios en mutantes de papa
donde la interrupción de la primera enzima
involucrada en la síntesis de fenilalanina y
tirosina (corismato mutasa) disminuye no solo
la fenilalanina, sino también, las ligninas y los
compuestos fenólicos (Verpoorte & Alfermann,
2000). Como la distribución de la fenilalanina
para la síntesis proteica o fenólica está deter-
minada por el balance de la demanda (Jones
& Hartley, 1999), se interpreta que la demanda
o competencia de fenilalanina para la síntesis
proteica –si ocurrió–, no impidió el suministro
del aminoácido para incrementar la síntesis de
fenoles en condiciones in vitro (Fig. 1). Como
la fotosíntesis es opcional en condiciones de
heterotrofia (Ahlert et al., 2003), la alta canti-
dad de sacarosa promueve la síntesis proteica
de una forma donde los genes de la fotosíntesis
autotrófica no se utilizan. Básicamente, los
genes implicados en la síntesis proteica durante
el cultivo in vitro se pueden eliminar sin afectar
la viabilidad celular y el desarrollo de la planta
(Ahlert et al., 2003).
Debido a la relación que existe entre los
niveles de especies reactivas de oxígeno con
el incremento en el contenido de compuestos
fenólicos, se podría argumentar que los proce-
dimientos de micropropagación ocasionaron
una afectación de magnitudes superiores al
estrés que sufren las plantas en condiciones
de campo, lo cual se reflejó en los contenidos
de fenoles de las plantas in vitro, cuyos valores
fueron superiores para todas las edades y para
todas las partes evaluadas (con excepción de los
tallos para los árboles de año y medio) (Fig. 3).
Existen investigaciones en las cuales se
mencionan que los altos niveles de compuestos
fenólicos en las plantas micropropagadas se
deben a la capacidad de secuestrar peróxido
de hidrógeno (H2O2) (Liu et al., 2018). Si lo
anterior se llegara a confirmar en G. arborea,
es necesario evaluar las estrategias de micro-
propagación específicas para la especie, pues
las plantas al estar estresadas producen especies
reactivas de oxígeno que tienen que contrarres-
tarse con el aumento de fenoles. La presencia
de plantas con fenotipos diferentes en el mismo
medio de cultivo puede ser el resultado de
plantas hiperhidratadas o un “envejecimiento”
ocasionado por la pérdida de competencia
morfogenética en cultivos in vitro a largo plazo
(Fig. 5) (Valledor et al., 2007). Es una hipótesis
que debe evaluarse en otro estudio, pero que
indica la necesidad de utilizar y/o complemen-
tar otros marcadores para concluir el efecto del
cultivo in vitro en el estrés de las plantas.
Las respuestas obtenidas del contenido de
fenoles en los árboles de siete y 20 años en com-
paración con las plantas de año y medio pueden
explicarse por las diferentes condiciones ecoló-
gico-ambientales que alteran de forma diferente
la biosíntesis de los metabolitos secundarios.
Puesto que, las plantaciones forestales se encon-
traban bajo el mismo fotoperiodo y tempe-
ratura, el aumento en el contenido de fenoles
se puede explicar por la salinidad del suelo, la
fertilización nitrogenada y fosfatada, así como,
por los distintos niveles de déficit hídrico entre
plantaciones (Pérez-Ochoa et al., 2022).
En lo que se refiere a los contenidos de
fenoles en plantas de campo, la mayoría de los
estudios se han realizado sobre la química foliar
(Koricheva & Barton, 2012). Los resultados
obtenidos muestran tendencias similares con
la investigación de Lim et al. (2017), donde
las hojas de Macaranga pruinosa tuvieron
10 Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 72: e54500, enero-diciembre 2024 (Publicado Ene. 19, 2024)
contenidos fenólicos totales mayores que tallos
y raíces. Los autores indican que la temporada
tiene un efecto en los valores promedios obteni-
dos en hojas de M. pruinosa. Otro resultado que
concuerda con esta investigación fue el publi-
cado por Dutta y Ray (2020), quiénes obtu-
vieron mayores fenoles totales en los extractos
metanólicos de las hojas en comparación con
el tallo. Por su parte, las conclusiones de Filová
(2014), indican que las raíces in vivo son las que
producen los mayores rendimientos de metabo-
litos secundarios debido a la variedad de estrés
ambiental a las que están expuestas.
La melina tiene una diversidad de fitoquí-
micos bioactivos con comprobada importancia
etnofarmacológica (Warrier et al., 2021). La
obtención in vitro de fenoles y ligninas sin el
uso de elicitores, son resultados prometedores
en el campo de la fitoquímica forestal, pues
existen plantas que no producen o producen
muy pocos compuestos en condiciones de cul-
tivo de tejidos (Verpoorte et al., 2002).
Otro aspecto que pudo influir en los con-
tenidos de fenoles y ligninas es el proceso de
secado, particularmente las muestras de los
tejidos in vitro. El estrés ocasionado por el daño
mecánico y la desecación generan alteraciones
bioquímicas en las células y tejidos previo al
secado, la cual es una fase sensible porque, en
dependencia del proceso, varía la concentra-
ción de los contenidos fenólicos de las muestras
(Kittibunchakul et al., 2022).
Los patrones obtenidos de la concentra-
ción de ligninas muestran una tendencia opues-
ta a lo indicado en la literatura. Debido a que
la deposición de lignina es una de las etapas
finales de la diferenciación de las células del
xilema y tiene lugar principalmente durante el
Fig. 5. Plantas in vitro de Gmelina arborea A. Fenotipos con posible hiperhidratación. B. Fenotipos normales. Imágenes
propias de la investigación. / Fig. 5. In vitro plants of Gmelina arborea A. Phenotypes with possible hyperhydration. B.
Normal phenotypes. Own images of the research.
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Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 72: e54500, enero-diciembre 2024 (Publicado Ene. 19, 2024)
engrosamiento secundario de la pared celular
(Rencoret et al., 2011), se esperaba, al menos
para la variable tallo, una fuerte correlación
positiva (entre más edad más lignina), pero los
árboles más longevos para todas las partes de la
planta mostraron los valores más bajos de estos
polímeros (Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4). Para
árboles de Eucalyptus globulus se demostró que
el contenido de ligninas totales aumenta de un
16 % en plantas de un mes hasta un 25 % en
planta de 9 años (Rencoret et al., 2011).
Además de los enfoques bioquímicos, es
necesario complementar los estudios con datos
epigenéticos. En algunas especies de árboles,
los niveles de metilación de ADN son mayores
en plantas adultas en comparación con plantas
juveniles (Bräutigam et al., 2013; Fraga et al.,
2002; Valledor et al., 2010). Durante la madu-
rez aumenta la metilación de novo debido al
proceso de diferenciación (Valledor et al., 2007;
Valledor et al., 2010). Este trabajo constituye el
primer eslabón para el diseño de experimentos
más robustos que puedan dar perspectivas del
funcionamiento bioquímico en cultivos in vitro
y ex vitro de árboles tropicales.
A pesar de ser los primeros datos que
evalúan la relación entre la ontogenia y las
condiciones de crecimiento de plantas clonales
de melina, se requieren acciones para mejo-
rar el alcance de los resultados, entre estas se
destacan: la optimización de los muestreos in
situ, debido a las diferencias significativas en
las concentraciones de fenoles y ligninas de
hojas de diferente tamaño tomadas de la misma
rama y altura del árbol (datos no mostrados),
la falta de medición de las proteínas totales
que podrían ayudar a explicar el compromiso
bioquímico central del modelo de competición
proteica, la evaluación en condiciones in vitro
de un mismo clon en diferentes ambientes
(heterotróficos, mixotróficos y autotróficos)
para comprender mejor la dinámica de la dis-
tribución de la fenilalanina durante la síntesis
proteica y fenólica en especies forestales.
Es la primera investigación que evalúa el
contenido de compuestos fenólicos y ligninas
presentes en diferentes tejidos de una especie
forestal de edades diferentes, por lo cual, son
los primeros valores de referencia acerca del
compromiso bioquímico para la síntesis fenóli-
ca según la edad y el gradiente morfoanatómico
de crecimiento específico. Las diferencias halla-
das en relación con estos metabolitos durante
todas las fases de crecimiento es información
valiosa para la determinación de índices bio-
químicos relacionados con los tiempos de apro-
vechamiento óptimo en el cultivo clonal de
especies forestales.
El estudio propone que los resultados obte-
nidos en condiciones de heterotrofia están
relacionados con el modelo de competición
proteico, debido a la absorción de sacarosa para
la síntesis proteica sin afectar la demanda (por
competencia) de fenilalanina para la síntesis
fenólica. La presencia de mayor contenido de
fenoles en las plantas in vitro y los altos conteni-
dos de ligninas en esta condición para los tallos
y raíces genera interrogantes en relación con la
edad fisiológica y ontogenética de las plantas
in vitro en comparación con plantas de campo.
Por tanto, se recomienda una caracterización
fitoquímica en cada etapa de desarrollo junto
con el uso de marcadores morfológicos, fisio-
lógicos y moleculares para explicar si los pro-
cesos del cultivo in vitro permiten revigorizar
materiales selectos en comparación con otros
estados de desarrollo ontogenético.
Declaración de ética: los autores declaran
que todos están de acuerdo con esta publica-
ción y que han hecho aportes que justifican
su autoría; que no hay conflicto de interés de
ningún tipo; y que han cumplido con todos
los requisitos y procedimientos éticos y legales
pertinentes. Todas las fuentes de financiamien-
to se detallan plena y claramente en la sección
de agradecimientos. El respectivo documento
legal firmado se encuentra en los archivos de
la revista.
AGRADECIMIENTOS
A Luis Diego Jiménez Alvarado del Centro
Agronómico Tropical de Investigación y Ense-
ñanza (CATIE) por su colaboración durante
los muestreos en las plantaciones de melina.
12 Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 72: e54500, enero-diciembre 2024 (Publicado Ene. 19, 2024)
A Gustavo Hernández Sánchez y William Her-
nández Castro del INISEFOR por su colabora-
ción durante las actividades de campo.
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