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Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 73: e61113, enero-diciembre 2025 (Publicado Mar. 13, 2025)
Esporogénesis y ultraestructura de las esporas
del helecho Anemia hirsuta (Anemiaceae)
Edgar Javier Rincón-Barón1*; https://orcid.org/0000-0003-1347-171X
Carolina Santos-Heredia1; https://orcid.org/0000-0001-7617-0581
Gerardo Andrés Torres-Rodríguez2; https://orcid.org/0000-0003-2381-2936
Lilian M. Passarelli3; https://orcid.org/0000-0002-8870-8622
1. Grupo de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas para la Sostenibilidad-CIBAS, Facultad de Ciencias Exactas,
Naturales y Agropecuarias, Campus Universitario Lagos del Cacique, Universidad de Santander, Calle 70 No 55-210,
Bucaramanga, Colombia; ed.rincon@mail.udes.edu.co (*Correspondencia);
car.santos@mail.udes.edu.co
2. Unidad de Microscopía Electrónica, Universidad del Cauca, carrera 2 # 1A-25 Museo de Historia Natural, Popayán,
Cauca, Colombia; gator@unicauca.edu.co
3. Laboratorio de Estudios de Anatomía Vegetal Evolutiva y Sistemática (LEAVES), Facultad de Ciencias Naturales y
Museo de La Plata, Universidad Nacional de la Plata, 64 entre 120 y diagonal 113, B1904 E, La Plata, Argentina;
lmpassarelli@yahoo.com.ar
Recibido 17-VII-2024. Corregido 11-IX-2024. Aceptado 06-II-2025.
ABSTRACT
Sporogenesis and ultrastructure of spores in the fern Anemia hirsuta (Anemiaceae)
Introduction: Research into the ontogeny of sporangia and sporogenesis of leptosporangiate ferns is scarce in
the scientific literature.
Objectives: To describe and analyze the ontogeny of sporangia, sporogenesis, micromorphology, and ultrastruc-
ture of mature spores of the fern Anemia hirsuta.
Methods: Fertile fronds of A. hirsuta were processed according to standard protocols for sectioning and embed-
ding samples in paraffin and resin. Sections in paraffin were stained with safranin-alcian blue, Toluidine Blue,
and PAS/amidoblack. Sections in resin were stained with Toluidine Blue. The samples were prepared for observa-
tion under scanning electron microscopy (SEM) to yield detailed descriptions. Mature spores were analyzed by
X-ray energy dispersion (XEDS). Ultrathin sections were obtained for transmission electron microscopy (TEM)
observation.
Results: The entire leptosporangium is formed from a basal and an apical cell derived from a single epidermal
cell of the fertile pinna. The mature leptosporangia are globose, with a subapical ring and a short pedicel. During
development, the tapetum is initially cellular, and then becomes plasmodial. The sporocytes undergo simultane-
ous meiotic division to form tetrads of spores in a tetrahedral arrangement. The exospore is formed first, with two
layers, a very thin internal layer and a thick outer layer, followed by the endospore, and finally the perispore. The
spores are trilete and muriform, with simple or branched siliceous microspines. The perispore associated with the
muri and grooves appears to be highly organized with evident ultrastructural differences.
Conclusions: The ontogeny of the sporangia and sporogenesis of A. hirsuta is similar to that previously described
for leptosporangiate ferns and recorded in some related fossil species. The highly structured and organized
https://doi.org/10.15517/rev.biol.trop..v73i1.61113
BOTÁNICA Y MICOLOGÍA
2Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075 Vol. 73: e61113, enero-diciembre 2025 (Publicado Mar. 13, 2025)
INTRODUCCIÓN
La familia Anemiaceae es considerada uno
de los grupos basales dentro de los helechos
leptosporangiados (Polypodiopsida), formando
un grupo monofilético junto con Lygodiaceae y
Schizaeaceae claramente definidos por análisis
moleculares y morfológicos (Labiak et al., 2015;
Pteridophyte Phylogeny Group I, 2016; Smith
& Kessler, 2017). En la actualidad, estos mismos
autores consideran a la familia monotípica con
un solo género Anemia Sw. conformado por
115 especies: 98 Neotropicales, 16 entre África
y Madagascar y una especie de la India. Esta
riqueza de especies se encuentra distribuida
en tres subgéneros: el subgénero Anemia, el
subgénero Anemiorhiza y el subgénero Mohria
(Smith & Kessler, 2017). La gran mayoría de
las especies en el neotrópico se concentran
en Brasil (70 especies) y México (20 especies)
(Labiak et al., 2015; Mickel & Smith, 2004;
Smith & Kessler, 2017), seguido por Colombia
(14 especies) (Murillo-Aldana & Murillo, 2017;
Murillo-Pulido & Murillo, 2004). La delimita-
ción taxonómica y sistemática de las especies
dentro Anemiaceae se dificulta por la hibrida-
ción y la poliploidía que son frecuentes en la
familia (Mickel, 1982; Mickel & Smith, 2004;
Smith & Kessler, 2017).
Morfológicamente, la familia Anemiaceae
se caracteriza por sus frondas hemidimórficas
(solo algunas especies con frondas holomórfi-
cas), leptosporangios con un anillo subapical
y esporas triletes, tetraédricas o globosas con
muros usualmente paralelos, lisos, equinados o
baculados (Labiak et al., 2015; Smith & Kessler,
2017). En particular, Anemia hirsuta (L.) Sw. se
distingue por sus frondas hemidimórficas con
perispore is observed. A high silica content in the microspines of the sporodermis is herein reported for the first
time in this group.
Key words: Anemiaceae; sporogenesis; sporocytes; sporodermis; tapetum; ultrastructure.
RESUMEN
Introducción: Las investigaciones sobre la ontogenia de los esporangios y esporogénesis de los helechos leptos-
porangiados son escasas en la literatura científica.
Objectivos: Describir y analizar la ontogenia de los esporangios, esporogénesis, micromorfología y ultraestructu-
ra de las esporas maduras del helecho Anemia hirsuta.
Métodos: Frondas fértiles de A. hirsuta fueron procesadas de acuerdo con protocolos estándar para la inclusión y
corte en parafina y resina. Secciones obtenidas en parafina se tiñeron con safranina-azul de alcian, azul de tolui-
dina y PAS/amidoblack. Las secciones obtenidas en resina fueron teñidas con azul de toluidina. Para descripciones
detalladas de los procesos, las muestras fueron preparadas para su observación con microscopía electrónica de
barrido (MEB). Las esporas maduras fueron analizadas por dispersión de energías de Rayos-X (XEDS). Se obtu-
vieron secciones ultrafinas para observación mediante microscopía electrónica de transmisión (MET).
Resultados: Todo el leptosporangio se forma a partir de una célula basal y una apical derivadas de una sola célula
epidérmica de la pinna fértil. Los leptosporangios maduros son globosos, con un anillo subapical, además de un
pedicelo corto. Durante el desarrollo, el tapete es inicialmente celular y luego se torna plasmodial. Los esporocitos
experimentan división meiótica simultánea para formar tétradas de esporas en disposición tetraédrica. Primero
se forma el exosporio, constituido por dos capas, una interna muy delgada y una capa externa gruesa, seguido del
endosporio y finalmente el perisporio. Las esporas son triletes y muriformes, con microespinas silíceas simples o
ramificadas. El perisporio asociado a los muros y a los surcos muestra ser altamente organizado y con evidentes
diferencias ultraestructurales.
Conclusiones: La ontogenia de los esporangios y esporogénesis de A. hirsuta es similar al descrito previamente
para helechos leptosporangiados, y a lo registrado en algunas especies fósiles relacionadas. El perisporio es
altamente estructurado y organizado. Se registra por primera vez en este grupo, alto contenido de sílice en las
microespinas presentes en la esporodermis.
Palabras clave: Anemiaceae; esporogénesis; esporocitos; esporodermis; tapetum; ultraestructura.
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segmentos de venación libre y márgenes ase-
rrados (Murillo-Pulido & Murillo, 2004; Smith
& Kessler, 2017).
A pesar de que los helechos leptosporan-
giados son considerablemente más diversos con
respecto a los grupos eusporangiados (Pterido-
phyte Phylogeny Group I, 2016; Sessa, 2018),
los estudios detallados sobre la esporogénesis
y ontogenia de los leptosporangios son escasos
(Rincón-Barón et al., 2019; Rincón-Barón et
al., 2020; Triana-Moreno, 2012; Wilson, 1999;
Yang et al., 2022). Se han hecho avances en el
entendimiento de la morfo-anatomía de los
esporofitos de Anemia (Albornoz et al., 2021;
Hernandez-Hernandez et al., 2012), así como
en la biología reproductiva, en especial con
el desarrollo de los gametofitos (Chambi &
Martínez, 2020; Nester & Schedlbauer, 1981)
y los detalles morfológicos y ultraestructurales
de las esporas (Dettmann & Clifford, 1991;
Ramos-Giacosa et al., 2012; Hill, 1979; Labiak
et al., 2015; Ramos-Giacosa, 2014; Ramos-
Giacosa et al., 2012; Tryon & Lugardon, 1991;
Tryon & Tryon, 1982) y de la tolerancia al
estrés hídrico (Nadal et al., 2021). En contras-
te, los mecanismos ontogénicos relacionados
con la esporogénesis en el género Anemia no
han sido descritos en detalle. En este trabajo
se presenta una descripción pormenorizada
del proceso de esporogénesis en la especie A.
hirsuta y se incluyen aspectos relacionados con
el desarrollo y diferenciación de la cápsula del
leptosporangio, formación y función del tapete,
estratificación y ultraestructura del esporoder-
mo; así como, la estructura y composición de
las micro-ornamentaciones equinadas presen-
tes en los muros y asociadas al perisporio de las
esporas maduras.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal objeto de estudio:
Durante los meses marzo y abril de 2021 se
obtuvieron ejemplares fértiles de A. hirsuta
en un vivero local. El material de referencia
(Rincón 027) se depositó en el Herbario de la
Universidad de Antioquia (HUA), Medellín,
Colombia. Los ejemplares fueron identificados
usando claves taxonómicas proporcionadas
por Murillo-Pulido & Murillo (2004), Mickel
(2016) y Smith y Kessler (2017). Los ejemplares
de A. hirsuta analizados presentan hojas hemi-
dimórficas con dos pinnas basales modificadas
que llevan los leptosporangios agrupados en
estructuras panniculiformes y con lamina foliar
fuertemente reducida (Fig. 1A).
Procesamiento histológico y descripción
de material vegetal mediante microscopía
fotónica: Para los estudios sobre la ontogenia
de los leptosporangios se tomaron 30 frondas
fértiles con estructuras reproductivas en dife-
rentes etapas de maduración. Este material se
fijó en una mezcla de formol, etanol y ácido
acético (FAA) por 24-48 horas a 6 °C, se
tomaron fragmentos de 1 cm2 de longitud, se
deshidrataron en la serie gradual de alcoholes
y aclaramiento en HistoChoice® Clearing Agent
(Ruzin, 1999) y finalmente se incluyeron en
Paraplast plus (Mc Cormick®) durante 12 horas
a 55 °C. Se obtuvieron secciones transversa-
les con micrótomo rotatorio MicroTec®, entre
5-7 μm de grosor. Las secciones obtenidas se
tiñeron con safranina-azul de alcian y azul de
toluidina para realizar descripciones de tejidos
con paredes primarias y secundarias, además
de resaltar la presencia de cutina, lignina y
esporopolenina (Rincón-Barón et al., 2019;
Rincón-Barón et al., 2020; Ruzin, 1999) y tam-
bién con PAS/amidoblack para más detalles
morfológicos relacionados con polisacáridos
(Soukup, 2014).Muestras adicionales de las
frondas fértiles fueron fijadas en Glutaralde-
hído al 2.5 % en buffer fosfato 0.2 M (pH 7.2)
durante 24-48 horas a 6 °C. Luego de la fijación,
las muestras se lavaron en el mismo buffer,
seguido de agua destilada para posteriormente
postfijarlas con tetróxido de osmio al 2 % por
2 horas a 6 °C en oscuridad y agitación ocasio-
nal. Finalmente, las muestras se deshidrataron
por dos horas en cada paso en una batería de
etanol en grado ascendente (30, 50, 70, 80, 90,
95 %) y dos cambios en etanol al 100 % por 12
horas. Posteriormente, las muestras se embe-
bieron a 4 °C en mezclas progresivas de óxido
de propileno-resina Spurr, durante dos días. Se
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Fig. 1. Anemia hirsuta: Morfología y ontogenia de los leptosporangios. A. Planta fértil. Frondas hemidimórficas sosteniendo
agrupaciones de leptosporangios. B-C. Leptosporangios maduros en las pinnas modificadas (Filtro ultravioleta y MEB,
respectivamente). C. Se destaca los anillos de los leptosporangios. D-L. Ontogenia de los leptosporangios. D-E. Los
leptosporangios presentan maduración asincrónica (safranina/azul de alcian). D-F. Se aprecian la célula basal y apical
de origen epidérmico que formarán los primordios de los leptosporangios (safranina/azul de alcian y azul de toluidina,
respectivamente). F-G. Primordios de los leptosporangios (azul de toluidina). H. Diferenciación del tapete celular
biestratificado y la cápsula del leptosporangio (azul de toluidina). I-K. Diferenciación del tapete plasmodial (azul de
toluidina). J-K. Se observa la formación de las cámaras plasmodiales al final de la meiosis. K-L. Tétradas de esporas en
desarrollo dentro de cámaras plasmodiales. K. Las tétradas de esporas no han desarrollado el exosporio (azul de toluidina). L.
Se aprecia un exosporio incipiente que engrosa a medida que maduran las tétradas de esporas (PAS-amidoblack). ASP: anillo
del leptosporangio; CA: célula apical; CAP: cámaras plasmodiales; CB: célula basal; CE: cubierta del esporocito; CP: cápsula
del leptosporangio; CTI: células tapetales iniciales; ES: esporas; ESP: esporocitos premeióticos; ESM: esporocitos meióticos;
EX: exosporio; GA: gránulos de almidón; NU: núcleo; NUC: nucléolo; NUT: núcleos del tapete plasmodial; PE: pedicelo
del leptosporangio; PIN: pinna; PS: pared del leptosporangio; PSP: primordios de los leptosporangios; SP: Leptosporangios;
TCB: tapete celular biestratificado; TP: tapete plasmodial; TRE: tétradas de esporas. / Fig. 1. Anemia hirsute. Morphology
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hicieron varios cambios de resina pura durante
48 horas en agitación constante. La resina fue
polimerizada a 60 °C por 48 horas. Se obtu-
vieron secciones de 0.5-0.7 μm de grosor con
cuchillas de vidrio en un ultramicrótomo Leica
Ultracut UCT®; las cuales se tiñeron con azul
de toluidina (TBO) en bórax al 1 % (pH 3.6)
por 30-60 segundos. Para más datos morfoló-
gicos y estructurales, muestras procesadas en
parafina y teñidas con safranina azul de alcian
se examinaron empleando el filtro de triple
banda de excitación DAPI-FITC-Texas RED, el
cual incorpora un filtro de excitación con ven-
tanas de paso de banda angostas en las regiones
espectrales violeta (395-410 nm), azul (490-505
nm) y verde (560-580 nm). Todas las secciones
obtenidas se examinaron con un microscopio
fotónico Nikon eclipse Ni equipado con el sis-
tema de contraste diferencial de interferencia
(CDI). Las fotografías se obtuvieron con cáma-
ra digital Nikon DS-Fi1® utilizando el programa
de manejo de imágenes NIS Elements, versión
4.30.02 (Nikon Instruments Inc.).
Procesamiento y descripción de material
vegetal mediante microscopía electrónica de
barrido y transmisión: Para la descripción
ultraestructural de la pared de las esporas
maduras se obtuvieron secciones ultrafinas 80
a 70 nm de grosor con cuchilla de diamante,
empleando las muestras procesadas y embebi-
das en resina como se indicó anteriormente.
Estas secciones se contrastaron con acetato de
uranilo y citrato de plomo durante 10 min y 5
min, respectivamente y se examinaron con un
microscopio electrónico de transmisión JEOL
JEM 1200 EX. Para llevar a cabo las descrip-
ciones morfológicas de los leptosporangios y
esporas maduras con microscopía electrónica
de barrido (MEB), las muestras se fijaron en
glutaraldehído al 4 % en buffer fosfato durante
24 horas, se lavó el exceso de fijador y se pro-
cedió a posfijar con tetraoxido de osmio al 1 %
por 4 horas a 6 °C. Las muestras se deshidra-
taron en dos cambios en 2.2 dimetoxipropano
acidificado por 4 y 12 horas, respectivamente
(Lin et al., 1977) y se procedió a dos cambios en
etanol al 100 % por 2 y 24 horas. Finalmente, las
muestras se pasaron a una mezcla 1:1 hexame-
tildisilazano (HMDS)-etanol al 100 % durante
12 horas y luego en HMDS puro durante este
mismo tiempo (Bhattacharya et al., 2020; Rin-
cón-Barón et al., 2024). Posteriormente se per-
mitió que el HMDS se evaporara en desecador
de vidrio. Las muestras se montaron sobre cinta
conductiva de carbono de doble cara y se recu-
brieron con oro utilizando un cobertor ióni-
co Quorum SC7620 durante 10 minutos. Las
observaciones y registro fotográfico, así como
el microanálisis por dispersión de energías de
Rayos-X (XEDS) de las microespinas presentes
en el perisporio de las esporas, se realizaron
en un microscopio electrónico de barrido FEG
(Field Emission Gun) QUANTA FEG 650. Para
las descripciones en general se utilizaron los
términos sensu Lellinger (2002).
and ontogeny of Leptosporangia. A. Fertile plant. Hemidimorphic fronds can be seen supporting clusters of leptosporangia.
B-C. Mature leptosporangia in modified pinnae (ultraviolet filter and SEM, respectively). C. Leptosporangia rings stand out.
D-L. Leptosporangia ontogeny. D-E. Leptosporangia exhibit asynchronous maturation (safranin/alcian blue). D-F. The basal
and apical cells of epidermal origin that will form the primordia of the leptosporangio are appreciated (safranin/alcian and
toluidine blue, respectively). F-G. Leptosporangial primordia (toluidine blue). H. Differentiation of the bi-stratified cellular
tapetum and the leptosporangium capsule (toluidine blue). I-K. Differentiation of the plasmodial tapetum (Toluidine Blue).
J-K. The formation of plasmodial chambers can be seen after meiosis. K-L. Spore tetrads developing within plasmodial
chambers. K. Spore tetrads have not yet developed the exospore (toluidine blue). L. An incipient exosporium is seen
that thickens as the spore tetrads mature (PAS-amidoblack). ASP: leptosporangia ring; CA: apical cell; CAP: plasmodial
chambers; CB: basal cell; CE: sporocyte coat; CP: leptosporangium capsule; CTI: initial tapetal cells; ESP: premeiotic
sporocytes; ESM: meiotic sporocytes; EX: exospore; GA: starch granules; NU: nucleus; NUC: nucleolus; NUT: plasmodial
tapetum nuclei; PE: leptosporangium pedicel; PIN: pinna; PS: leptosporangium wall; PSP: primordia of leptosporangia; SP:
leptosporangia; TCB: bistratified cellular tapetum; TP: plasmodial tapetum; TRE: spores tetrad.
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RESULTADOS
Los leptosporangios se ubican en las
pinnas reducidas formando dos hileras; son
globosos y presentan un característico anillo
subapical (Fig. 1B, Fig. 1C). En estas pinnas, es
posible encontrar leptosporangios en diferentes
momentos de maduración, es decir, la madu-
ración es mixta o asincrónica (Fig. 1D, Fig.
1E). Sin embargo, cuando la pinna fértil llega
a su máximo momento de desarrollo, todos los
leptosporangios han madurado y la actividad
meristemática que los forma se detiene por
completo (Fig. 1A).
La diferenciación de los leptosporangios en
el tejido foliar de las pinnas modificadas se pro-
duce a partir de una sola célula epidérmica; la
cual se divide por plano oblicuo dando origen a
la célula basal y la apical (Fig. 1D, Fig. 1F). Una
vez que se han diferenciado la célula basal y la
apical, éstas experimentan divisiones mitóticas
sucesivas en varios planos, para formar los
primordios de los leptosporangios que se carac-
terizan por presentar una estructura corta que
corresponde al pedicelo y una porción expan-
dida terminal globosa que corresponde a la
cápsula incipiente del leptosporangio (Fig. 1F).
Con el desarrollo de los primordios de los
leptosporangios, se forman los esporocitos pre-
meióticos que se dividen para formar una capa
de células parietales de contorno rectangular
que se diferenciarán en las células tapetales
iniciales (Fig. 1F). Posteriormente, estas células
se dividen en un plano periclinal para formar
el tapete celular biestratificado que rodea a
los esporocitos premeióticos (Fig. 1G). Con el
avance en el desarrollo de los leptosporangios,
los esporocitos premeióticos se dividen activa-
mente por mitosis aumentando en número (Fig.
1H). Para esta etapa del desarrollo, la capa más
externa del tapete presenta contorno rectangu-
lar aplanado con aspecto vacuolado, en tanto
que la capa del tapete celular próxima a los
esporocitos premeióticos, es de contorno cua-
drangular con un núcleo en posición central,
por lo general con un nucléolo y citoplasma
de aspecto granular (Fig. 1H). Los esporoci-
tos premeióticos también presentan contorno
cuadrangular y núcleo central y estos pueden
tener hasta tres nucléolos y el citoplasma fuer-
temente granular (Fig. 1H). Así mismo, la pared
del leptosporangio está constituida por una
capa uniestratificada de células epidérmicas
cuadrangulares con una sola vacuola que ocupa
la mayor parte del citoplasma y un núcleo volu-
minoso con varios nucléolos (Fig. 1H).
Con el crecimiento y desarrollo del lep-
tosporangio, la capa más interna del tapete
celular va perdiendo su integridad y se trans-
forma en un tapete plasmodial, que invade pro-
gresivamente a los esporocitos premeióticos,
rodeándolos hasta aislarlos por completo y esti-
mulándolos para entrar en meiosis. Esta acti-
vidad se refleja en el cambio de aspecto de los
esporocitos, que se tornan de contorno globoso,
con una gruesa cubierta, un núcleo altamente
eucromático, sin nucléolos y el citoplasma de
aspecto granular con abundantes gránulos de
almidón (Fig. 1I). Además, se pudo apreciar
que la capa más externa del tapete celular, las
células tapetales iniciales, persiste hasta este
momento y hasta la liberación de las esporas.
Una vez que el tapete plasmodial rodea a
los esporocitos por completo, estos experimen-
tan meiosis de tipo simultánea formando tétra-
das de esporas en disposición tetraédrica (Fig.
1J, Fig. 1K); para este momento del desarrollo,
el tapete plasmodial rodea por completo a las
tétradas que se encuentra incluidas en cáma-
ras plasmodiales. Estas cámaras se aprecian
como estructuras translúcidas poco teñidas que
rodean a las tétradas de esporas y limitan con
el tapete plasmodial. Así mismo, el tapete plas-
modial se aprecia como un sincitio funcional de
aspecto denso y granular (Fig. 1K). Las tétradas
de esporas inicialmente se encuentran juntas en
la misma cámara plasmodial, donde continúan
su desarrollo y allí se deposita el exosporio que
se aprecia como una capa delgada fucsia claro al
teñir con safranina (Fig. 1L) y este se va engro-
sando progresivamente tornándose de un color
fucsia oscuro (Fig. 1L).
En contraste, al teñir con azul de toluidina,
el exosporio se torna de un color azul turquesa
brillante (Fig. 2A). El engrosamiento progre-
sivo del exosporio termina con la formación
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Fig. 2. Tétradas de esporas, anillo del leptosporangio y esporas maduras de Anemia hirsuta A-C. Maduración de las tétradas
de esporas, depósito del esporodermo y tapete plasmodial. En el detalle en C, anillo del leptosporangio completamente
diferenciado. A-B. Azul de toluidina. C. PAS-amidoblack. D-E. Leptosporangios y esporas maduras excitadas con luz
ultravioleta (Filtro UV, material vegetal fresco). D. Cavidad del leptosporangio con varias esporas (Filtro DAPI-FITC-Texas,
safranina/azul de alcian). E. Se evidencia la autofluorescencia del anillo del leptosporangio y de las esporas maduras al ser
excitadas con luz ultravioleta (Filtro UV, material vegetal fresco). F-I. Detalles micromorfológicos de las esporas (MEB). F.
Vista polar distal. G. Vista polar proximal. H. Vista ecuatorial. I. Patrón de microornamentación muriforme con surcos lisos
y presencia de microespinas ramificadas o no, en los muros. J. Microanálisis por dispersión de energías de Rayos-X (MEB-
XEDS) de las microespinas presentes en los muros de las esporas. Se destaca un alto contenido de sílice (flecha y resaltado
en amarillo). K-L. Detalles ultraestructurales del esporodermo (MET). K. Región de los surcos. Se observa un endosporio
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del patrón de microornamentación muriforme,
constituido por muros paralelos característico
de las esporas (Fig. 2B, Fig. 2C). Finalmente, se
deposita el endosporio que corresponde a una
capa muy fina que delimita con el citoplasma de
las esporas y con el exosporio (Fig. 2 C). Junto
con este proceso de desarrollo, las células en la
región apical del leptosporangio se diferencian
aumentando de tamaño y desarrollando engro-
samientos lignificados sectorizados en forma
de “U” diferenciándose el anillo del leptospo-
rangio (Fig. 2C).
Con la maduración y diferenciación de
las esporas, estas se ubican en cámaras plas-
modiales individuales (Fig. 2B, Fig. 2C). Para
el momento de la liberación de las esporas, el
tapete plasmodial experimenta autolisis hasta
desaparecer, dejando a las esporas maduras
libres en la cavidad del leptosporangio (Fig.
2D). Las células del anillo del leptosporan-
gio emiten autofluorescencia amarilla-naranja
demostrando la presencia de lignina (Fig. 2E),
en tanto que las esporas maduras en fresco al
ser iluminadas con luz ultravioleta presentan
autofluorescencia amarillo-verdoso debido a
la presencia de esporopolenina. Estas esporas
son tetraédricas, con simetría radial, hetero-
polares, ámbito triangular a subtriangular en
vista polar distal, se establece una zona con
diferentes formas, siendo la triangular, peque-
ña, la más frecuente (Fig. 2F). La lesura trilete
abarca la totalidad de la cara polar proximal y
concluye en el ángulo de la espora (Fig. 2G).
El diámetro ecuatorial en vista ecuatorial (VE)
mide 105-100 µm y el diámetro polar (en VE)
75-54 µm y el diámetro ecuatorial (en vista
polar) es de 90-40 µm. En vista ecuatorial la
forma de la espora es semi-esferoidal, con la
delgado, un exosporio de dos capas: uno interno y otro externo grueso. El exosporio interno se observa como una capa delgada
electrodensa que limita con el endosporio. El perisporio está formado por dos estratos: uno interno denso con pocas escamas
electrolúcidas (asterisco) y otro externo de aspecto microgranular (doble asterisco). L. Se aprecia la región de los muros, que
se diferencia ultraestructuralmente de la zona de los surcos, con un exosporio externo grueso (en la imagen no se muestra
el exosporio interno). El perisporio interno está conformado por tres estratos: uno denso (flecha) en contacto íntimo con
el exosporio externo, un estrato medio formado por tres a cuatro capas de escamas (asterisco) y un estrato externo también
denso (doble asterisco). En el perisporio externo se aprecian dos estratos: uno grueso de aspecto microgranular (estrella) y
otro delgado denso (doble estrella). ASP: anillo de los leptosporangios; CAP: cámaras plasmodiales; CIT: citoplasma de las
esporas; CTI: células tapetales iniciales; EN: endosporio; ES: esporas; ESC: escamas; EX: exosporio; EXE: exosporio externo
EXI: exosporio interno; LE: lesura trilete; MER: microespinas ramificadas; MES: microespinas; MU: muros; MUA: muros
anastomosado; MUC: muro central; PER: perisporio; PS: pared del leptosporangio; SP: leptosporangios; SU: surcos; TP:
tapete plasmodial; TRE: tétradas de esporas; ZT: zona triangular. / Fig. 2. Spore tetrads, leptosporangium ring, and mature
spores of Anemia hirsuta. A-C. Maturation of spore tetrads, deposition of sporoderm and plasmodial tapetum. In detail C, the
fully differentiated leptosporangium ring can be appreciated. A-B. Toluidine blue. C. PAS-amidoblack. D-E. Leptosporangia
and mature spores. D. Cavity of the leptosporangium, including several spores (DAPI-FITC-Texas filter, safranin/alcian
blue). E. Autofluorescence of the leptosporangium ring and mature spores is visible when they are excited with ultraviolet
light (UV filter, fresh plant material). F-I. Micromorphological details of the spores (SEM). F. Distal polar view. G. Proximal
polar view. H. Equatorial view. I. Muriform microornamentation pattern, with smooth grooves and branched or non-
branched microspines in the muri. J. Energy-dispersive X-ray microanalysis (SEM-XEDS) of the microspines present in
the muri. A high silica content stands out (arrow and highlighted in yellow). K-L. Ultrastructural details of the sporoderm
(TEM). K. In the grooves, a thin endospore is observed, as well as an exospore of two layers: an internal one and a thick
external one. Internal exospore appears as a thin, electron-dense layer surrounding the endospore. The perispore is formed of
two strata: a dense internal one with few electro-lucent scales (asterisk) and an external one with a microgranular appearance
(double asterisk). L. The murus region can be observed, which is ultrastructurally differentiated from the groove area by a
thick external exospore (the internal exospore is not shown in the image). The internal perispore is constituted by three
strata: a dense one (arrow) in close contact with the external exospore, a middle stratum formed by three to four strata of
scales (asterisk), and an external stratum that is also dense (double asterisk). In the external perispore, two strata can be seen:
a thick one with a microgranular appearance (star) and a thin, dense one (double star). ASP: leptosporangial ring; CAP:
plasmodial chambers; CIT: spore cytoplasm; CTI: initial tapetal cells; EN: endospore; ES: spores; ESC: scales; EX: exospore;
EXE: external exospore; EXI: internal exospore; LE: trilete lesure; MER: branched microspines; MES: microspines; MU:
muri; MUA: anastomosig muri; MUC: central murus; PER: perispore; PS: wall of the leptosporangium; SP: leptosporangia;
SU: grooves; TP: plasmodial tapetum; TRE: spore tetrads; ZT: triangular zone.
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cara proximal recta y la distal convexa (Fig.
2H). La ornamentación es positiva, es decir, con
elementos de la exina elevados sobre la super-
ficie, con muros delgados de 3 µm de ancho
por 3.4 µm de alto y surcos más anchos de 8.5
µm, que se disponen en formaciones paralelas
a cada lado del triángulo central formado por
la lesura (Fig. 2G) y estos muros se unen en la
zona ecuatorial formando una línea continua
que culmina en la lesura (Fig. 2H). Los muros
presentan microespinas bajas con ápices agu-
dos o truncados, la mayoría de los procesos
están bifurcados o ramificados y se ubican en
forma variable, miden entre 2 y 2.8 µm, algunas
zonas no presentan microornamentación (Fig.
2I). Las microespinas dispuestas en los muros
presentan diferencias en su tono, apareciendo
blancas o de un tono más claro que el resto de la
esporodermis (Fig. 2I); los análisis por disper-
sión de energías de Rayos-X detectaron que las
microespinas contienen abundante sílice (Fig.
2J). La lesura trilete presenta procesos similares
al resto de la esporodermis (Fig. 2I).
Utilizando microscopía electrónica de
transmisión, en la zona de los surcos se dis-
tingue la ultraestructura de la esporodermis,
formada por un exosporio homogéneo, muy
desarrollado, de 1 µm de grosor, siendo el
perisporio más complejo y con un espesor
menor (0.3 µm), el endosporio forma una capa
muy delgada (0.1 µm), uniforme (Fig. 2K). En
el exosporio se aprecian dos capas; una interna
que limita con el endosporio, muy delgada, más
contrastada y una capa externa muy gruesa y
compacta, no se observan perforaciones (Fig.
2K). En la zona de los muros, el exosporio
mantiene la estructura similar a la zona de los
surcos, el perisporio en cambio tiene mayor
desarrollo (0.7 µm) y está formado por un
perisporio interno diferenciado en tres capas
(Fig. 2L). Una capa interna en contacto con el
exosporio, muy delgada, fuertemente contras-
tada. La capa media, menos contrastada que
la interna, de aspecto irregular, formada por
tres o cuatro estratos de escamas y una capa
externa muy delgada y contrastada (Fig. 2L).
Así mimo, el perisporio externo está forma-
do por dos capas, una gruesa microgránular,
estos microgránulos se pueden apreciar unidos
dando la impresión de formar cordones; la otra
capa es delgada, densa y delimita el contorno de
la espora (Fig. 2L).
DISCUSIÓN
Algunos autores han indicado para hele-
chos leptosporangiados que el desarrollo y
maduración de los esporangios es asincrónico
o mixto (Gifford & Foster, 1989; Rincón-Barón
et al., 2019; Rincón-Barón et al., 2020; Triana-
Moreno, 2012) lo cual es coincidente con las
observaciones para A. hirsuta en esta investi-
gación y podría tratarse de un mecanismo de
adaptación a las condiciones ambientales para
favorecer la viabilidad de los gametofitos, tal y
como lo sugieren estas mismas investigaciones.
En A. hirsuta los procesos ontogenéticos
relacionados con la formación de los primor-
dios de los leptosporangios constituidos ini-
cialmente por una célula apical y otra basal que
posteriormente experimentan divisiones celu-
lares en varios planos para formar el pedicelo
y la cápsula del leptosporangio; además de las
características citomorfológicas de los esporo-
citos premeióticos y de las divisiones celulares
que experimenta para formar las células tape-
tales iniciales a medida que los leptosporangios
maduran y se desarrollan, son similares a lo
descrito previamente para helechos leptospo-
rangiados (Rincón-Barón et al., 2019; Rin-
cón-Barón et al., 2020; Triana-Moreno, 2012;
Wilson, 1999; Yang et al., 2022); lo que implica
que estos eventos son conservados para este
grupo de plantas.
En helechos leptosporangiados, el tapete
biestratificado se forma por la división de las
células tapetales iniciales, lo cual determina
que la pared de la cápsula del leptosporangio
en esta etapa del desarrollo quede formada por
tres capas celulares: la pared del leptosporangio
que es uniestratificado y el tapete celular que es
biestratificado (Rincón-Barón et al., 2019; Rin-
cón-Barón et al., 2020; Parkinson, 1995; Yang et
al., 2022); estas características son coincidentes
con lo observado en esta investigación para A.
hirsuta. Así mismo y en relación con el tapete,
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varios autores han descrito como la capa más
interna del tapete celular biestratificado sufre
autolisis perdiendo así la integridad celular,
formando un tapete plasmodial que progresi-
vamente invade a los esporocitos premeióticos;
en tanto que la capa de las células tapetales
iniciales se mantiene hasta la liberación de las
esporas (Parkinson, 1995; Rincón-Barón et al.,
2019; Rincón-Barón et al., 2020; Yang et al.,
2022). Estos eventos también coinciden con las
observaciones registradas en esta investigación
para A. hirsuta.
Los esporocitos de A. hirsuta al ser invadi-
dos por el tapete plasmodial experimentan una
diferenciación morfocitológica, tornándose de
contorno globoso con una gruesa cubierta y un
núcleo fuertemente eucromático, marcando el
inicio de la meiosis; estos cambios en los espo-
rocitos estimulados por el tapete plasmodial,
han sido indicados en otras especies de hele-
chos incluidos leptosporangiados y en algunos
licófitos siendo considerados esenciales para
el desarrollo de las esporas (Parkinson, 1987;
Parkinson, 1995; Rincón-Barón et al., 2011;
Rincón-Barón et al., 2013; Rincón-Barón et
al., 2019; Rincón-Barón et al., 2020; Uehara &
Kurita, 1991). Lo cual resalta la importancia del
tapete como tejido nutricio y origen de los com-
ponentes de la esporodermis tanto de las espo-
ras como los granos de polen (Yao et al., 2022).
Furness et al. (2002) indican que la meiosis
de tipo simultánea termina con la formación
de tétradas en disposición tetraédrica y se
relaciona con la formación de esporas y gra-
nos de polen triletes; lo cual es coincidente
con nuestras observaciones para A. hirsuta.
No obstante, estas observaciones difieren con
respecto a otras especies de helechos leptos-
porangiados que producen esporas monole-
tes mediante meiosis de tipo simultánea en
lugar de sucesiva (Rincón-Barón et al., 2019;
Rincón-Barón et al., 2020).
En helechos homospóricos como en hete-
rospóricos, se ha demostrado que durante la
ontogenia de la espordermis primero se deposi-
ta el exosporio, luego el endosporio y finalmen-
te el perisporio, si está presente (Rincón-Barón,
Rolleri, Alzate-Guarin & Dorado-Gálvez, 2014;
Rincón-Barón, Rolleri, Passarelli et al., 2014;
Rincón-Barón et al., 2019; Rincón-Barón et al.,
2020; Wallace et. al. 2011; Tryon & Lugardon,
1991; Uehara & Kurita, 1991; Uehara et al.,
1991). Estos mismos autores, indican que, para
el momento de la liberación de las esporas, el
tapete plasmodial se degrada dejándolas libres
en la cavidad del esporangio. Las observaciones
anteriores son congruentes con lo registrado en
esta investigación para A. hirsuta.
Rincón-Barón, Rolleri, Passarelli et al.
(2014) y Rincón-Barón et al. (2020) observaron
que cuando las esporas maduras de Lycopodia-
ceae y Pleopeltis macrocarpa (Bory ex.Willd.)
Kaulf. son excitadas con luz ultravioleta, emiten
autofluorescencia amarillo-verdoso en tanto
que el anillo del esporangio con estas mismas
condiciones emite autofluorescencia amarillo-
naranja; producto de estas observaciones, con-
cluyeron que la autofluorescencia característica
de estas estructuras se debe principalmente a la
presencia de esporopolenina y lignina respec-
tivamente. Estos mismos autores corroboraron
estos hallazgos con las tinciones de safranina/
azul de alcian y azul de toluidina. La safranina
tiñe de color fucsia a la esporopolenina y a la
lignina; en contraste, el azul de toluidina tiñe
de color azul turquesa a la esporopolenina
y azul claro o azul verdoso a la lignina. Las
observaciones en esta investigación para A.
hirsuta son congruentes con estas conclusio-
nes y son corroboradas por análisis extensos
hechos en tejidos vegetales (Roshchina, 2008;
Ruzin, 1999).
Las esporas maduras del género Anemia
se caracterizan por una ornamentación muri-
forme, con muros paralelos, que distingue
a la familia Anemiaceae incluso en material
fósil de sedimentos, constituyendo el grupo de
esporas cicatricosas halladas desde el Jurásico
superior y Cretácico inferior (Archangelsky
& Archangelsky, 2010; Archangelsky et al.,
2012; Labiak et al., 2015). Esta uniformidad
en la ornamentación de la esporodermis, tiene
patrones bien definidos de organización de los
muros y surcos.
Dettman y Clifford (1991) refieren la pre-
sencia de seis tipos morfológicos diferentes
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Revista de Biología Tropical, ISSN: 2215-2075, Vol. 73: e61113, enero-diciembre 2025 (Publicado Mar. 13, 2025)
basados en la ornamentación, uno reticulado
en Anemia wrightii Baker, también mencionado
como tipo inusual por Tryon & Tryon (1982)
y el resto el típico cicatricoso con muros con
diferente grado de ornamentación. Ramos-
Giacosa et al. (2012), realizan una división más
sencilla para las especies de Anemia de Argen-
tina y distinguen dos tipos morfológicos bien
diferenciados, uno con muros paralelos, el tipo
Anemia herzogii Rosenst. que presenta muros
estrechos y paralelos con báculas, separadas por
surcos amplios y el tipo Anemia australis (Mic-
kel) M. Kessler & A.R. Sm. con muros paralelos
separados por surcos estrechos y suaves con
ángulos prominentes y redondeados. Las espo-
ras de A. hirsuta pertenecen al primer grupo,
y según Tryon & Tryon (1982), estas esporas
presentan caracteres que las distinguen de otras
especies del género compartidos por Anemia
oblongifolia, los muros y surcos como la forma
y disposición de los procesos, y la forma general
de la espora son caracteres específicos.
La presencia de sílice en A. hirsuta, evi-
denciada por una importante diferencia de
tonalidad en las microespinas y procesos del
perisporio al observarlas con MEB y comple-
mentado con los análisis XEDS constituye un
aspecto nuevo, no registrado previamente. La
sílice es componente común en algunos grupos
de plantas y se relaciona con resistencia al estrés
biótico y abiótico (Kumar et al., 2017). Especí-
ficamente en helechos se ha identificado como
componente importante del cuerpo vegetativo
de las plantas que refuerza las paredes celulares
dando soporte mecánico y permitiendo cierto
grado de resistencia a la herbivoría (Currie &
Perry, 2007, Mazumdar, 2011; Sundue, 2009).
En estudios recientes, se ha indicado la
importancia de la sílice en hojas de Selaginella
P. B ea uv. formando una estructura parecida a
una lente, permitiéndole a la planta adaptarse a
condiciones de poca luz, algo también descrito
para esporas de resistencia de algas diatomeas
(Shih et al., 2022). En las esporas de helechos
eusporangiados este componente ha sido docu-
mentado en Equisetum L., Selaginella e Isoetes
L. (Corrêa-Lopes & Feio, 2020; Currie & Perry,
2007, Law & Exley, 2011; Macluf et al., 2003;
Macluf, Meza-Torres & Solís, 2010; Macluf,
Morbelli & Giudice, 2010; Polevova & Moi-
seenko, 2023; Taylor, 1992; Taylor 1993; Volkov,
et al., 2019), aunque los autores no indican
alguna posible función.
En esporas de helechos leptosporangiados,
no se ha registrado la presencia de sílice; por
lo que los hallazgos de esta investigación cons-
tituyen un aspecto nuevo, no explorado sobre
las esporas de este grupo de plantas. Dado que
la sílice, se registra acá por primera vez en A.
hirsuta, específicamente en las microespinas
relacionadas con el perisporio y aunque no se
conoce bien su función, este elemento podría
estar relacionado con mecanismos de pro-
tección al estrés biótico y/o abiótico (Currie
& Perry, 2007) que les da resistencia hasta el
tiempo de germinación. En relación con lo
anterior y teniendo en cuenta que el mecanis-
mo de dispersión de las esporas más conocido
o más frecuente en helechos leptosporangiados,
se relaciona con el disparo de estas a manera
de catapulta, dada las características biome-
cánicas del anillo del leptosporangio (Llorens,
et al., 2016); poco se conoce sobre el efecto
de la microornamentación de las esporas y
su relación con la dispersión. En este sentido
Dias y Branco (2023), analizaron, entre otros,
la relación de las microespinas presentes en
las esporas Trichomanes speciosum Willd. y
la posible dispersión de estas adheridas a las
plumas de las aves. No obstante, y en concor-
dancia con estos autores, consideramos que esta
hipótesis que relaciona microornamentación de
las esporas versus dispersión, necesita de más
investigación para poder ser validada. También
recientemente, Gómez-Noguez et al. (2022)
indican la importancia de la microornamen-
tación de las esporas con su aerodinámica y la
facilidad de dispersión.
En cuanto a la ultraestructura observada
en este trabajo, coincide con otros autores que
han estudiado la esporodermis en el género
Anemia, un exosporio muy ancho y denso
formando los muros y un perisporio mucho
más delgado, pero con diferentes formas en
su estructura, con escamas microgránulos y
diversidad de organización de los elementos
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intra-perisporio (Dettmann & Clifford, 1991;
Tryon & Lugardon, 1991; Tryon & Tryon 1982).
Existe una marcada diferencia de grosor y
desarrollo del perisporio en la zona de los
muros y de los surcos, con la presencia de tres
capas que se distinguen por su electrodensidad.
Aunque varios autores describen y documentan
la presencia de perforaciones en el exosporio
(Dettmann & Clifford, 1991), no es el caso de A.
hirsuta cuyo exosporio es muy compacto. Se ha
demostrado la presencia de esporas anormales
en ejemplares de Anemia tomentosa (Savigny)
Sw. de Argentina, estas esporas son aletes,
esferoidales y con escasas diferencias a nivel de
escultura, aunque en algunos casos la ornamen-
tación puede faltar y los muros ser de menor
tamaño; con la estructura de la esporodermis
similar a la que se observa en esporas normales
(Ramos-Giacosa, 2014); en A. hirsuta no se
observó la presencia de esporas anormales.
Declaración de ética: los autores declaran
que todos están de acuerdo con esta publica-
ción y que han hecho aportes que justifican
su autoría; que no hay conflicto de interés de
ningún tipo; y que han cumplido con todos
los requisitos y procedimientos éticos y legales
pertinentes. Todas las fuentes de financiamien-
to se detallan plena y claramente en la sección
de agradecimientos. El respectivo documento
legal firmado se encuentra en los archivos de
la revista.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de Santander (UDES) por
el apoyo institucional y financiero. A la Univer-
sidad del Cauca (UNICAUCA) por su apoyo
técnico e infraestructura.
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