Nutrición Animal Tropical 19 (1): 125-158. Enero-Junio, 2025
ISSN: 2215-3527 / DOI: 10.15517/1qrw6g94
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1
Esta investigación formó parte del trabajo de graduación de maestría del primer autor. Maestría en Ciencias Pecuarias. Universidad
del Tolima, Ibagué, Colombia.
2Universidad del Tolima. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Ibagué, Colombia. Autor de correspondencia:
dkvillalbao@ut.edu.co (https://orcid.org/0000-0002-7249-333X).
3✝Universidad del Tolima. Departamento de Producción Pecuaria. Ibagué, Colombia. Correo electrónico: jrmora@ut.edu.co
(https://orcid.org/0000-0003-2680-5846).
4Universidad del Tolima. Sistemas Agroforestales Pecuarios Grupo de Investigación. Ibagué, Colombia. Correo electrónico:
jrmora@ut.edu.co (https://orcid.org/0000-0002-1093-4216).
Recibido: 03 agosto 2024 Aceptado: 25 junio 2025
Esta obra está bajo licencia internacional CreativeCommons Reconocimiento-NoComercial-SinObrasDerivadas 4.0.
Artículo científico
Dinámica microbiana
in vitro
de un ensilaje de
Sorghum saccharatum
enriquecido
con y sin inóculos de
Lactobacilli
sp.1
Diana Katherine Villalba2, Vilma A. Holguín3✝, Jairo Mora-Delgado4
RESUMEN
El objetivo de la presente investigación fue analizar la dinámica microbiana de un ensilaje de
Sorghum saccharatum
(SD) enriquecido con inóculos de
L. plantarum
y
L. buchneri
, con el fin
de determinar la cinética de degradación de la materia seca (MS) de forma
in vitro
. La
investigación se llevó a cabo en El Espinal, Tolima, Colombia. Se evaluaron tres tratamientos:
T1: ensilado de SD sin inoculación; T2: ensilado de SD inoculado con
Lactobacillus buchneri
(concentración de 6x105 UFC/g); T3: ensilado de SD inoculado con
Lactobacillus plantarum
(concentración de 1x105 UFC/g) con 5 repeticiones cada uno. La calidad microbiológica se
evaluó en dos tiempos de fermentación: el primer día y a los 21 días. La producción de gas se
midió en ambos tiempos a 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 19, 24, 30, 36, 48 y 72 horas. Asimismo, las
cinéticas de degradación de la MS se monitorearon a las 6, 12, 24, 48 y 72 horas. Los parámetros
de las cinéticas de fermentación y las curvas de degradación se ajustaron a los modelos
propuestos por Ørskov y McDonald, utilizando el procedimiento PROC NLIN de SAS. Para
determinar el efecto de los tratamientos sobre la degradación de la MS, se realizó un análisis
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de medidas repetidas en el tiempo, utilizando el procedimiento PROC MIXED de SAS. Los
resultados mostraron 92,9 ± 0,6 mg de CO2/g de sustrato seco en el pico de la curva, lo que
indicó una disminución del 37,85% en la población microbiana, siguiendo una tendencia
inversa logarítmica. Se concluyó que el sorgo dulce posee bacterias epífitas que permiten un
desempeño adecuado de la fermentación y una buena capacidad de acidificación del medio.
Los aditivos comerciales no tuvieron efecto sobre las cinéticas de degradación y fermentación
de los ensilados.
Palabras clave: Bacterias ácido-lácticas, microbiología, materia seca, digestibilidad,
bromatología.
ABSTRACT
In vitro
microbial dynamics of a
Sorghum saccharatum
silage enriched with and without
Lactobacilli
sp inoculants
.
The dry matter (DM) degradation kinetics and microbial dynamics of
Sorghum saccharatum
(SS) enriched with additives based on
Lactobacillus plantarum
and
Lactobacillus buchneri
were determined
in vitro
. Three treatments were evaluated: T1: SS silage
without inoculation; T2: SS silage inoculated with
Lactobacillus buchneri
(concentration of 6x105
CFU/g); T3: SS silage inoculated with
Lactobacillus plantarum
(concentration of 1x105 CFU/g),
with 5 replicates each. Microbiological quality was evaluated at two fermentation times: the
first day and at 21 days. Gas production was measured at 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 19, 24, 30, 36, 48,
and 72 hours. Likewise, DM degradation kinetics were monitored at 6, 12, 24, 48, and 72 hours.
The parameters of the fermentation kinetics and degradation curves were adjusted to the
models proposed by Ørskov and McDonald, using the PROC NLIN procedure of SAS. To
determine the effect of treatments on DM degradation, a repeated measures analysis over time
was performed using the PROC MIXED procedure of SAS. The results showed 92.9 ± 0.6 mg
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Lactobacillus
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CO2/g dry substrate at the peak of the curve, which indicated a 37.85% decrease in the
microbial population, following a logarithmic inverse trend. It is concluded that sweet sorghum
has epiphytic bacteria that allow adequate fermentation performance and a good capacity to
acidify the medium. Commercial additives did not affect the degradation and fermentation
kinetics of the silage.
Keywords: Lactic acid bacteria, microbiology, dry matter, digestibility, bromatology.
INTRODUCCIÓN
Los sistemas de producción de rumiantes en Colombia se basan en el pastoreo, lo que
condiciona su rendimiento a la calidad y cantidad de forraje disponible en los pastos. La
estacionalidad en la producción de forrajes constituye una limitante, ya que durante las épocas
secas se presenta escasez de alimento, mientras que en otras épocas ocurre una
sobreproducción asociada a las altas precipitaciones (Miguel et al., 2019). Debido a esto, las
prácticas de alimentación y suplementación estratégica a partir de recursos forrajeros
tropicales constituyen una opción tecnológica amigable con el medio ambiente (Holguín et al.,
2015). En este sentido, el uso de forrajes alternativos, y su conservación, constituyen una
estrategia viable. De esta manera, el desafío consiste en cómo conservar los forrajes para diferir
su uso entre épocas de alta producción y escasez sin perder calidad. El ensilaje se presenta
como una alternativa viable para este propósito (Holguín et al., 2018b).
La búsqueda de alternativas que fortalezcan los sistemas de alimentación animal, en particular
durante los periodos de escasez, es fundamental en las regiones tropicales (Holguín, 2016). En
este contexto, es necesario evaluar el valor nutricional de los forrajes alternativos y de los
ensilajes mediante metodologías prácticas y confiables, que generen información relevante
para la toma de decisiones a nivel de finca (Huertas et al., 2021).
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Desde la última década del siglo XX, el sorgo ha sido objeto de estudio como fuente forrajera,
en estado fresco o ensilado, para la alimentación del ganado, debido a su tolerancia a la sequía,
alto potencial de rendimiento y adaptabilidad a distintas condiciones edáficas (Souza et al.,
2013). La principal preocupación en el uso del sorgo para ensilaje es el potencial de rendimiento
de materia seca (MS) de toda la planta, que oscila entre 9 y 20 t/ha (Oktem y Oktem, 2022); y
representa un potencial significativo en la producción de forraje de sorgo y ensilado para la
nutrición del ganado (Houx III et al., 2013; Xie y Xu, 2019). El sorgo forrajero, debido a su alto
contenido de azúcares solubles en el tallo, se considera adecuado para la producción de
ensilajes (Colombini et al., 2010; 2012; Cattani et al., 2017). Sin embargo, la calidad del ensilaje
puede optimizarse mediante la aplicación de aditivos inoculantes que potencien los procesos
fermentativos (Fazaeli et al., 2006). Investigaciones anteriores han reportado una adecuada
fermentación y calidad del ensilaje de sorgo, particularmente en zonas áridas o con limitaciones
hídricas (Zhang et al., 2015; Zhang et al., 2016).
Las características del material a ensilar son decisivas para la calidad del producto, ya que el
crecimiento de las bacterias ácido-lácticas (BAL) permite que el pH del silo disminuya (Bezabih
y Tamir, 2014), lo que se representa menores pérdidas de la masa ensilada. La calidad del
ensilado depende de diversos factores entre los que se destacan las características del forraje
y los cambios que se generan en su fermentación. Este último factor depende, en gran medida,
del tipo de microorganismos que colonicen el sustrato y del pH que alcance el silo, así como
de la velocidad con la que se produzca este proceso (Kung, 2010).
Para mejorar los procesos de fermentación, los aditivos juegan un papel importante. Sin
embargo, es importante tener claro que el aditivo no puede sustituir un buen manejo del
proceso de ensilaje. Un aditivo no previene los efectos negativos de una mala fermentación
del forraje, causada por cubiertas plásticas permeables al oxígeno o por un almacenamiento
prolongado a temperaturas superiores a 30 ºC (Kung, 2018).
Los inoculantes microbianos contienen bacterias seleccionadas para dominar los cultivos
microbianos presentes en el silo y optimizar los procesos de fermentación. Según el tipo de
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de ensilaje enriquecido con
Lactobacillus
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fermentación que realizan sobre azúcares presentes en las plantas, como la glucosa, estos
inoculantes se clasifican en dos categorías: homofermentadores y heterofermentadores. Los
homofermentadores producen exclusivamente ácido láctico, y dentro de este grupo se
incluyen especies como
Lactobacillus plantarum
,
Pediococcus
spp. y
Enterococcus
spp. Por
otro lado, los heterofermentadores generan no solo ácido láctico, sino también ácido acético,
etanol y dióxido de carbono. El mejor ejemplo de este grupo es
Lactobacillus buchneri
(Reich
y Kung, 2010; Muck et al., 2018; Koc et al., 2017).
Los inoculantes bacterianos presentan varias ventajas sobre otros aditivos, como su bajo costo,
seguridad de uso, baja tasa de aplicación y ausencia de residuos o impactos ambientales
negativos. Sin embargo, los resultados de su aplicación pueden ser variables, probablemente
debido a las diferencias en las condiciones del ensilaje al momento de la aplicación. Cuando
se combinan con enzimas que degradan la pared celular y el almidón, aumentan la
disponibilidad de carbohidratos para la fermentación láctica, lo que mejora tanto la
fermentación como el valor nutricional del ensilaje de pastos y leguminosas tropicales (Muck
et al., 2018).
Además, las cepas de bacterias ácido-lácticas (BAL) epífitas presentes en los forrajes tropicales
son candidatas prometedoras para su uso como aditivos en el ensilaje (Heinritz et al., 2012).
Por ello, es fundamental identificar aquellas cepas con capacidad para favorecer la
fermentación láctica (especialmente cepas homofermentativas) en el forraje objetivo (Holguín
et al., 2018a).
Existen diferentes métodos para evaluar la efectividad del proceso de ensilaje. Aunque la
calidad bromatológica de los ensilados es un indicador útil, es fundamental también evaluar y
conocer la velocidad de degradación de estos alimentos en el rumen, ya que este factor es
decisivo y sirve como herramienta clave para la formulación adecuada de raciones (Rossi et al.,
2016).
Para determinar los procesos de ensilaje se debe evaluar la actividad microbiológica del
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ensilado, ya que son los encargados de realizar el proceso de fermentación esencial para el
adecuado proceso de conservación que representará el éxito o fracaso de la técnica (Kung et
al., 2018). Para monitorear la cinética de degradación del ensilado a evaluar se utiliza la técnica
de producción de gas, la cual es un método
in vitro
que permite determinar la extensión y
cinética de degradación del alimento a través del volumen de gas producido durante el
proceso fermentativo (Theodorou et al, 1994).
La técnica de producción de gas
in vitro
permite establecer una relación lineal positiva entre la
degradación de la materia seca y la producción de gas durante el proceso de fermentación.
Esta relación indica que cuanto mayor es la degradación del sustrato, mayor es el volumen de
gas que se produce. La degradación de la materia seca puede producir diferentes volúmenes
de gas (Mao et al., 2014; Posada y Noguera, 2005). La hipótesis constituye la guía de la
investigación: la calidad del ensilado de sorgo dulce suplementado con aditivos de
L. buchneri
y
L. plantarum
puede mejorarse y afectar positivamente la cinética de degradación ruminal
in
vitro
. El estudio tuvo como objetivo analizar la dinámica microbiana de un ensilado de
Sorghum
saccharatum,
enriquecido con inóculos de
L. plantarum
y
L. buchneri
para determinar la
cinética de degradación de la materia seca.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo de sorgo
El forraje utilizado para ensilaje fue el sorgo dulce variedad HT 70. Se cultivó en el Centro de
Investigación Nataima, de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria
(Agrosavia). Este se encuentra a una altura de 418 m s.n.m., cuyas coordenadas geográficas
son de 4°11’31.65’’ latitud norte (N) y 74°57’41.49’’ longitud oeste (W). Está ubicado en la
microrregión del valle cálido del Alto Magdalena, en el departamento del Tolima, municipio de
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El Espinal, Colombia; en una zona clasificada como Bosque Seco Tropical (BsT). Según
Holdridge (1977), presenta suelos en su mayoría franco arenosos, una temperatura media de
28 °C, una precipitación de 1250 mm al año con distribución bimodal y una humedad relativa
del 70% (Carvajal, 2004).
La región cuenta con dos temporadas de lluvias principales (marzo-junio y septiembre-
noviembre) y dos de sequía (diciembre-febrero y julio-agosto). El sorgo puede sembrarse al
inicio de cada temporada de lluvia para aprovechar la humedad. Previo al establecimiento del
sorgo dulce, se hizo un arado y rastreo para romper la compactación del suelo, mejorar la
aireación y favorecer la germinación de las semillas.
Preparación del ensilaje
Para este estudio, el forraje de sorgo se cultivó durante la primera temporada lluviosa,
correspondiente a inicios de marzo, con el fin de cosecharlo en junio a los 90 días, en estado
de grano pastoso con 70% de humedad. Al forraje cosechado se le redujo el tamaño de
partícula a 2 cm, en un molino de tres aspas a 7,5 HP, 1400 rpm y 4,5 Amps marca Gaitán. Una
vez picado el forraje se realizó una mezcla manual.
Aditivos y tratamientos
A raíz del interés de los productores de comprobar la efectividad de inoculantes comerciales,
se evaluaron dos aditivos frente a la microflora epifita nativa del forraje de sorgo. Los aditivos
se aplicaron en los niveles recomendados por el fabricante, con el objetivo de proporcionar 1
× 10⁵ UFC/g. Para ello, los inoculantes se diluyeron en 10 mL de agua desionizada y la
suspensión se asperjó uniformemente sobre 100 kg de forraje picado (peso húmedo),
utilizando una bomba manual, para cada uno de los tratamientos. Los microrganismos se
aplicaron a los forrajes de manera uniforme con mezcla constante. Los tratamientos fueron:
Tratamiento 1 (T1): ensilado de sorgo dulce sin inóculo (grupo control); Tratamiento 2 (T2):
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ensilaje de sorgo dulce + aditivo
L. buchneri
con una concentración de 6X105 UFC/g;
Tratamiento 3 (T3): ensilaje de sorgo dulce + aditivo
L. plantarum
con una concentración de
1X105 UFC/g.
Recolección de muestras de ensilaje
Se prepararon microensilajes de 5 kg utilizando bolsas de polietileno calibre 6 (0,06 milésimas
de pulgada), las cuales fueron compactadas, selladas manualmente y almacenadas. Se
establecieron tres tratamientos con cinco repeticiones cada uno. La humedad al momento del
almacenamiento fue del 77 %. Se realizó un análisis bromatológico los días 1 y 21 del proceso.
Los ensilajes fueron abiertos en cuatro ocasiones correspondientes a los días 1, 7, 14 y 21, para
la toma de muestras. Estas se secaron en una estufa de ventilación forzada a 60 °C durante 48
horas, y posteriormente fueron molturadas en un molino con tamiz de 1 mm. De esta manera,
se llevaron a cabo cuatro evaluaciones con una frecuencia de siete días.
Análisis bromatológico
La materia seca se determinó mediante deshidratación en una estufa de vacío a 105 °C durante
48 horas. Los contenidos de fibra detergente neutra (FDN) y fibra detergente ácida (FDA) se
analizaron siguiendo la metodología descrita por Van Soest y Wine (1967). El contenido de
nitrógeno se evaluó mediante el método de Kjeldahl (Nielsen, 1994), y a partir de este se calculó
la proteína cruda. El extracto etéreo se determinó por el método de Soxhlet, y el contenido de
cenizas mediante el método de residuo mineral fijo descrito por la AOAC (1990).
Preparación del sistema in vitro
Siguiendo el protocolo de Duque et al. (2009), se obtuvo el fluido ruminal de dos vacas Holstein
fistuladas en el rumen para la colecta del inoculo. Las vacas estuvieron pastoreando una
pradera de
Pennisetum clandestinum
sin suministro de concentrado. La colecta se hizo a las
6:00 am de forma manual y se almacenó en recipientes térmicos precalentadas con agua a 40
ºC. Posteriormente, se transportó al laboratorio donde se filtró a través de paños de algodón.
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El fluido se transfirió a un Erlenmeyer que se mantuvo a una temperatura de 39 ºC y fue
gaseado permanentemente con CO2 para garantizar condiciones anaeróbicas.
Preparación de matraces de incubación
La producción de gases originados por la fermentación de la MS se determinó mediante la
técnica semiautomática de producción de gas
in vitro
descrita por Mauricio et al. (1999). Se
utilizaron frascos de vidrio con capacidad de 100 mL, previamente lavados y secados en estufa
a 110 °C durante 12 horas. En cada uno de ellos se pesó aproximadamente 0,5 g de forraje.
Después de eso, se agregaron a cada matraz 5 mL de líquido ruminal y 45 mL de la solución
tampón. Los frascos se sellaron con tapón de goma, se agitaron manualmente y se transfirieron
a un horno de ventilación forzada a 39 ºC (tiempo cero).
Incubación
Siguiendo el procedimiento descrito por Duque et al. (2009), se utilizaron como blancos una
serie de matraces que contenían medio de cultivo e inóculo, pero sin sustrato, con el fin de
corregir la presión generada por la saturación con CO₂ y la fermentación de los
microorganismos presentes en el líquido (Theodorou et al., 1994). Estos matraces, que
contenían medio de cultivo, muestra e inóculo, fueron gaseados con CO₂ y sellados con
tapones de goma de 14 mm. Posteriormente, se colocaron en cajas de poliestireno de 1,5 cm
de espesor para su incubación, y se incubaron en una estufa de ventilación forzada a 39 °C. El
número de días de incubación y los intervalos de evaluación se establecieron según el método
de Theodorou et al. (1994).
Recolección de gases y muestreo de MS
Los tiempos de fermentación a partir del sellado del silo fueron los días 1 y 21, en los cuales se
evaluaron cinco repeticiones de cada uno. En seguida, se realizó la preparación del medio; para
ello, la solución tampón se preparó un día antes del inicio del experimento según lo
recomendado por McDougall (1948). La solución se realizó con 9,80 g/L de NaHCO3, 4,65 g/L
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de Na2HPO4·2H2O, 0,57 g/L de KCl, 0,47 g/L de NaCL, 0,12 g/L de MgSO4.7H2O y 0,05 g/L de
CaCl2.2H2O (Silva y de Queiroz, 2002). Dichos reactivos se disolvieron en agua destilada,
agitando vigorosamente para permitir la mezcla completa de las soluciones y se saturó con
CO2 durante dos horas, posteriormente, se almacenó a 39 ºC.
Lecturas de producción de gas
Se usó un transductor de presión digital tipo OMEGA Modelo PX 605-030GI para medir la
presión derivada de la acumulación de gases de la fermentación. Se insertó una aguja a través
de la tapa de goma de las botellas para conectarla después a una manguera del transductor.
Las lecturas de presión de gas en libras por pulgada cuadra (PSI) se realizaron a las 2, 4, 6, 8,
10, 12, 15, 19, 24, 30, 36, 48, 72 horas de incubación. Luego de cada lectura, los matraces se
agitaron manualmente y se retornaron a la incubadora.
La trasformación de datos de presión a volumen se realizó con la siguiente ecuación:
Y = -0,1375 + 5,1385X + 0,0777X2
Donde Y representa el volumen de gas producido por cada unidad de presión (X) (Posada y
Noguera 2005).
Degradación in vitro de materia seca (MS)
La cinética de degradación de la MS se analizó retirando los frascos de vidrio del periodo de
incubación a diferentes tiempos: 6, 12, 24, 48 y 72 horas. Los residuos resultantes de la
incubación se separaron mediante papel filtro de peso conocido, se secaron a 65 °C durante
48 horas y posteriormente se pesaron para calcular la desaparición de la materia seca (Duque
et al., 2009).
Evaluación de la calidad microbiológica
La evaluación de la dinámica microbiológica de los lactobacilos se realizó en el Laboratorio de
Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Ciencia Animal de la Universidad del
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Tolima. Para ello, se desarrolló la cinética de degradación de MS y producción de gas en el
Laboratorio de Nutrición de Rumiantes perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrícolas,
ubicado en la Sede Universitaria de Investigación, Universidad de Antioquia, Medellín,
Colombia.
Se estudió la calidad microbiológica de los ensilajes, utilizando los parámetros de recuento de
unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias, mohos y levaduras. Se evaluó la presencia
de patógenos como
Listeria
,
Salmonella
y
Clostridium
. Para ello, se utilizaron aditivos
comerciales, cuya dilución se realizó siguiendo las recomendaciones del laboratorio. Para
verificar la concentración de las poblaciones de lactobacilos y las unidades formadoras de
colonias (UFC) utilizadas en cada tratamiento, se sembró una muestra de cada uno.
Se evaluaron tres tratamientos, cada uno con cinco repeticiones de la población de bacterias
productoras de ácido láctico (LAB), a lo largo de cuatro tiempos de fermentación: 1, 7, 14 y 21
días. La variable evaluada fue la concentración de lactobacilos, expresada en UFC/g.
Análisis estadístico
Para comparar las características microbiológicas, se analizaron los resultados de las variables
en dos momentos: el día 1 y el día 21. Para ello, se aplicó la prueba no paramétrica de Wilcoxon
para comparar los valores entre ambos momentos. Además, para detectar diferencias entre los
tratamientos en cada tiempo de fermentación, se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal-
Wallis. Esta misma prueba se aplicó específicamente para evaluar los valores de lactobacilos.
También se realizó un análisis de varianza (ANOVA) con un modelo de dos factores y medidas
repetidas en uno de ellos. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software SPSS
versión 20.0 (IBM, 2011).
Por otro lado, para estimar los parámetros cinéticos de fermentación y degradación, las curvas
de producción de gas y degradación de MS se ajustaron a los modelos propuestos por Ørskov
y McDonald (1979):
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p= a+b (1-e-ct)
Donde:
p = tasa de degradación a lo largo del tiempo.
α = fracción soluble en agua.
b = fracción no soluble en agua, potencialmente degradable.
c = tasa de degradación de la fracción b.
t = tiempo de incubación.
Por medio del procedimiento PROC NLIN de SAS (2001), se determinó el efecto de los
tratamientos sobre la degradación de la materia seca (MS) a lo largo del tiempo. Además, se
realizó un análisis de medidas repetidas utilizando el procedimiento PROC MIXED de SAS
(2001), en colaboración con la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Antioquia.
RESULTADOS
Análisis bromatológico
En la materia seca (MS) se observaron diferencias significativas (p < 0.05) únicamente en el T2
entre los días 1 y 21. Para el contenido de cenizas, se detectaron diferencias significativas (p <
0.05) entre los tratamientos 1 y 2 en ambos tiempos evaluados. En cuanto a la proteína cruda
(PC), el día 1 se encontraron diferencias entre T1 y T2, mientras que en el día 21 se observaron
diferencias entre T2 respecto a T1 y T3, así como entre T2 y T3. No se detectaron diferencias
significativas (p > 0.05) entre tratamientos en el día 1 para las variables FDN y FDA; sin embargo,
a los 21 días sí se observaron diferencias significativas (p < 0.05) en FDN entre T2 y T3 (Cuadro
1).
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Cuadro 1. Características bromatológicas de ensilajes de sorgo dulce en dos tiempos de
fermentación.
(%)
Tiempo de
fermentación (día)
T1
T2
T3
MS
1
22,99 ± 1,39a
24,73 ± 1,04a
23,31 ± 1,46a
21
22,49 ± 0,61a
22,55 ± 1,48a
22,37 ± 0,61a
Cen
1
8,11 ± 0,40a
7,43 ± 0,16b
7,81 ± 0,22ab
21
8,01 ± 0,33a
7,36 ± 0,40b
7,79 ± 0,41ab
EE
1
4,38 ± 1,45a
6,63 ± 2,47a
5,54 ± 2,38a
21
5,03 ± 1,58a
5,49 ± 1,04a
5,34 ± 0,96a
PC
1
6,90 ± 0,58a
5,90 ± 0,21b
6,02± 0,13ab
21
6,78 ± 0,26ac
6,34 ± 0,17b
6,80 ± 0,27c
FDN
1
53,62 ± 2,36a
54,62 ± 1,62a
52,14 ± 0,68a
21
54,30 ± 1,47a
54,10 ± 2,56a
55,05 ± 1,44a
FDA
1
37,08 ± 1,53a
38,07 ± 1,05a
37,74 ± 1,26a
21
39,50 ± 1,74a
41,24 ± 1,70a
41,52 ± 1,54a
MS: materia seca; Cen: cenizas; EE: extracto etéreo; PC: proteína cruda; FDN: fibra detergente neutra;
FDA: fibra detergente ácido. Letras diferentes en la misma fila por tiempo de fermentación (1 día y 21
días) indican valores estadísticamente diferentes (p < 0.05).
Calidad microbiológica
Los resultados obtenidos en la evaluación microbiológica de los ensilajes muestran una
reducción de la presencia de microorganismos patógenos con el proceso de fermentación, lo
que concuerda con la disminución de los niveles de pH, detectándose una diferencia
significativa (p < 0.05) de estos valores a lo largo del tiempo. Si bien en las pruebas iniciales se
detectó la presencia de
Salmonella
en el T2, se pudo controlar con la disminución del pH y con
las condiciones óptimas de fermentación, inhibiendo su crecimiento y proliferación, estando
ausente 21 días. La presencia de hongos y levaduras aumentó durante la fermentación tanto
en el T1 como en el T3 y disminuyó en el T2 (Cuadro 2).
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Cuadro 2. Evaluación microbiológica de ensilajes de sorgo dulce inoculados con
Lactobacillus.
Bacterias
T1
T2
T3
Día 1
Día 21
Día 1
Día 21
Día 1
Día 21
Aerobios mesófilos (UFC/g)
158,00x105
36,20x105
228,00x105
0,19x105
254x105
58,60x105
Coliformes totales (NMP)
98,20x104
100,00
242,10x104
100,00
252,00x104
10,00
Reductores de sulfito de
Clostridium
(UFC/g)
10
10
14
10
10
16
Hongos y levaduras spp (UFC/g)
50,20x104
175,00x104
80,00x104
0,40x104
51,60x104
834,00x104
Escherichia coli
/ 25g
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
Salmonella
spp / 25g
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
Listeria
spp
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
Lactobacillus
Se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos estudiados al día 21 (Cuadro 3).
En el momento de fermentación correspondiente al día 21 los valores de
Lactobacillus
aumentaron significativamente para el T1, mientras que para el T2 el aumento fue moderado
y para el T3 disminuyó (Figura 1).
Cuadro 3. Población de lactobacilos en ensilajes de sorgo dulce inoculados con lactobacilos
(valores dados como 106 UFC/g).
Semanas
Tratamientos (106 UFC/g)
Significancia
T1
T2
T3
1
616 ± 620
789 ± 332
931 ± 620
0.40
2
1998 ± 1659
788 ± 431
739 ± 470
0.47
3
1857 ± 1720
655 ± 239
295 ± 323
0.18
4
2479 ± 1359
1005 ± 297
316 ± 196
0.01
Villalba, et al. Dinámica microbiana
in vitro
de ensilaje enriquecido con
Lactobacillus
.
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Figura 1. Población de
Lactobacillus
a través de los tiempos de fermentación en ensilajes de
sorgo dulce enriquecidos con aditivos.
Parámetros de degradación de MS
Al comparar los resultados de la fracción rápidamente degradable (A) entre los tratamientos y
en cada uno de los tiempos de fermentación (días 1 y 21), se observó que no hubo diferencias
significativas (p > 0.05) entre los ensilajes preparados con aditivos de
Lactobacillus
y el ensilaje
sin aditivo. No obstante, al comparar los tratamientos entre sí, se puede observar que la
fracción A estimada fue mayor en el T2, seguido del T1, posiblemente debido a su mayor
concentración de carbohidratos solubles. En cuanto a la fracción lentamente degradable (B),
los resultados del día 1 fueron mayores para el T3, mientras que en el día 21 fueron mayores
para el T2 (Cuadro 4)
0
500
1000
1500
2000
2500
1 2 3 4
Lactobacillus
UFC/mg x 106
Semanas
T1 T2 T3
Nutrición Animal Tropical
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Cuadro 4. Valores promedio de los parámetros de degradación estimados a partir de la técnica
de producción de gas
in vitro
.
Parámetros
(%)
Dia 1
Dia 21
T1
T2
T3
T1
T2
T3
A
17,09
17,61
14,15
6,43
7,77
5,04
B
56,13
58,64
62,05
57,22
58,59
53,71
C
0,02
0,01
0,02
0,02
0,02
0,02
Degradación potencial
73,22
76,25
76,20
63,65
66,36
58,75
Fracción indigestible
26,78
23,75
23,80
36,35
33,64
41,25
A: fracción rápidamente degradable, B: fracción lentamente degradable, C: tasa constante de
degradación de la fracción B, Degradación potencial: A + B, Fracción indigestible: 100- (A + B).
Para la fracción potencialmente degradable, la tasa de degradación y la fracción no digerible,
no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos (p > 0.05) en los tiempos de
fermentación evaluados. Esto permite concluir que dichos parámetros no se vieron afectados
por el tipo de aditivo utilizado en la preparación de los ensilajes. Asimismo, no se encontraron
diferencias significativas (p > 0.05) al comparar los dos tipos de aditivos dentro de cada uno
de los tiempos de fermentación (Figura 2).
Villalba, et al. Dinámica microbiana
in vitro
de ensilaje enriquecido con
Lactobacillus
.
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Figura 2. Degradación
in vitro
de la materia seca (MS) de los tratamientos en diferentes
tiempos.
Parámetros de producción de gas
Los parámetros cinéticos de producción de gas para los tratamientos, volumen acumulado de
producción de gas después de 72 horas de incubación (VF), tiempo de colonización (L) y tasa
de producción de gas, se presentan en el Cuadro 5.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
612 24 48 72
Degradación de la MS (%)
Horas
(b) Día 21
T1 T2 T3
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
612 24 48 72
Degradación de la MS (%)
Horas
(a) Día 1
T1 T2 T3
Nutrición Animal Tropical
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Los volúmenes finales de producción de gas fueron similares entre tratamientos (p > 0.05), lo
que indica que los aditivos no tuvieron efecto sobre el volumen de gas producido, según los
resultados obtenidos.
Cuadro 5. Parámetros de producción de gas estimados para los tratamientos en estudio.
VF= volumen acumulado de producción de gas (mL) correspondiente a la digestión completa del
sustrato; L = tiempo de colonización expresado en horas.
El tiempo de colonización, definido como el intervalo necesario para la hidratación y
colonización de las bacterias en el sustrato, requisito previo para iniciar la degradación, no se
vio afectado por el tipo de aditivo (p > 0.05). No obstante, se observó que en el día 1 el ensilaje
con aditivo
Lactobacillus buchneri
(T2) requirió más tiempo para iniciar el proceso de
fermentación. De forma similar, en el día 21, el T3 presentó el mayor tiempo de colonización,
seguido del T1, lo que sugiere que la tasa de producción de gas se vio influenciada por la
concentración de carbohidratos de fermentación rápida (Cuadro 5).
El factor de partición (FP) relaciona los miligramos de sustrato degradado con el volumen de
gas producido, por lo que se considera un indicador de eficiencia microbiana (Cardona-Iglesias,
et al. 2017). En la Figura 3 se puede observar que los valores de FP disminuyen con el tiempo
de incubación en cada tratamiento, lo que indica una actividad microbiana constante durante
el proceso de fermentación. El FP no se vio afectado por el tipo de aditivo (p > 0.05). Sin
embargo, se detectaron diferencias significativas (p < 0.05) en el tiempo de fermentación del
día 1, donde el T1 difirió de T2 y T3, así como en el día 21.
Parámetros
Día 1
Día 21
T1
T2
T3
T1
T2
T3
VF, mL
295,00
299,20
289,30
256,00
268,90
239,90
L, horas
0,47
1,57
1,14
2,93
3,92
2,97
Villalba, et al. Dinámica microbiana
in vitro
de ensilaje enriquecido con
Lactobacillus
.
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Figura 3. Factor de partición que relaciona la cantidad de sustrato degradado (mg) y el volumen
de gas producido (mL) durante los procesos de incubación.
La producción acumulada de gas, expresada en mL/g de materia seca incubada, para los tres
tratamientos evaluados en todos los tiempos de lectura, se muestra en la Figura 4. Durante el
primer día de fermentación, no se observaron diferencias significativas (p > 0.05) en el volumen
0
2
4
6
8
10
612 24 48 72
Sustrato dgradado (mg/mL gas)
Horas
(a) Día 1 T1 T2 T3
0
2
4
6
8
10
612 24 48 72
Sustrato degradado (mg/mL gas)
Horas
(b) Día 21 T1 T2 T3
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de gas acumulado entre tratamientos. No obstante, a los 21 días de fermentación, en las
primeras horas de lectura (4, 6 y 8 horas), se presentaron diferencias significativas (p < 0.05),
siendo el volumen de gas acumulado en el T2 diferente con respecto a T1 y T3.
Figura 4. Volumen de gas acumulado (mL/g de MS incubada) durante todos los tiempos de
medición para los tratamientos en estudio.
0
50
100
150
200
250
300
0 2 4 6 8 10 12 15 19 24 30 36 48 72
Gas (mL/gr MS)
Horas
(a) Día 1
T1 T2 T3
0
50
100
150
200
250
300
0 2 4 6 8 10 12 15 19 24 30 36 48 72
Gas (mL/gr MS)
Horas
(b) Día 21
T1 T2 T3
Villalba, et al. Dinámica microbiana
in vitro
de ensilaje enriquecido con
Lactobacillus
.
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DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en esta investigación indican que los valores de los principales
nutrientes del ensilaje de sorgo dulce se encuentran dentro de los rangos reportados en
estudios previos (Caraballo, 2010). Este hallazgo sugiere que, desde el punto de vista
bromatológico, el sorgo dulce constituye una alternativa viable como forraje conservado en
condiciones tropicales.
Sin embargo, la inclusión de aditivos a base de
Lactobacillus
no mostró un efecto positivo en
la mejora de las características nutricionales del ensilaje, lo que sugiere que la inoculación con
estos microorganismos podría no ser necesaria bajo condiciones similares a las del presente
estudio (Villalba, 2013). Este resultado cuestiona la necesidad de adicionar cultivos iniciadores
en regiones tropicales donde, posiblemente, las condiciones ambientales ya favorecen un
adecuado proceso fermentativo.
En cuanto a la calidad microbiológica, se evidenció una disminución del pH hasta niveles
promedio de 3,5, lo cual permitió la estabilización del material y la inhibición del crecimiento
de bacterias patógenas. Este comportamiento coincide con lo reportado en ensilajes
elaborados en regiones no tropicales, donde los cereales alcanzan un pH final más bajo (3,7–
4,0) en comparación con las leguminosas (4,3–5,0), debido a su menor capacidad tampón
(Kung et al., 2018).
Asimismo, los resultados confirman que las condiciones de anaerobiosis, humedad y contenido
de carbohidratos solubles fueron adecuadas para propiciar una fermentación eficiente. Estas
condiciones favorecieron la rápida acidificación del material, lo que permitió su conservación,
efecto que puede potenciarse mediante procesos de inoculación cuando las condiciones
iniciales no son óptimas (Chen et al., 2019).
Los resultados obtenidos muestran que T1 y T3 presentaron un aumento progresivo en la
vvvvvv
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población de levaduras a lo largo del periodo de fermentación, mientras que en el T2 se
observó una disminución significativa. Esta reducción podría explicarse por el reemplazo de las
levaduras por un subgrupo de microorganismos capaces de utilizar ácidos orgánicos como
fuente de energía. Cabe destacar que un ensilaje con una elevada concentración de levaduras
(≥10⁵ UFC/g) se considera inestable en presencia de oxígeno (Kung et al., 2018; Schmidt y
Charley, 2011; Herrera et al., 2007).
En este estudio se emplearon tanto aditivos de primera como de segunda generación. Los de
primera generación compuestos por bacterias lácticas homofermentativas, que favorecen la
producción de ácido láctico y mejoran la conservación de la materia seca, pero no poseen
propiedades antimicrobianas contra levaduras, lo cual limita su capacidad para mejorar la
estabilidad aeróbica del ensilaje (Kung et al., 2018; Herrera et al., 2007). En estos casos, el
predominio del ácido láctico en la masa ensilada reduce la producción de ácidos con efecto
inhibidor sobre las levaduras, como el ácido acético (Andrade y Mohamad, 2010). Por el
contrario, los inoculantes de segunda generación, que contienen bacterias heterofermentativas
como
Lactobacillus buchneri
, generan ácido acético durante la fermentación, el cual ha
demostrado tener un efecto inhibidor sobre las levaduras al reducir su proliferación o competir
con ellas por los recursos disponibles (Andrade y Mohamad, 2010; Kung et al., 2018).
La presencia de levaduras a lo largo del proceso fermentativo también podría interpretarse
como un indicador de una rápida acidificación del ensilaje inducida por los inoculantes
(Ramírez-Díaz et al., 2020). De hecho, Chamberlain (1987) sugirió que una acidificación
acelerada podría favorecer el desarrollo de levaduras, ya que las bacterias ácido-lácticas
tienden a crecer en asociación con estos microorganismos. Aunque las levaduras suelen
encontrarse en menor número (Ravyts et al., 2012), pueden aprovechar los azúcares residuales
para producir etanol, especialmente cuando el ácido láctico se genera rápidamente y se
preserva una alta disponibilidad de carbohidratos solubles (Kundiyana et al., 2010).
Una mayor proliferación de levaduras durante el almacenamiento puede iniciar procesos de
vvv
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in vitro
de ensilaje enriquecido con
Lactobacillus
.
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fermentación secundaria al momento de abrir el silo, lo que compromete la estabilidad
aeróbica del material. Esta situación ha sido reportada particularmente en ensilajes no
inoculados (Franco y Pérez-Díaz, 2012).
Si bien los aditivos se utilizan comúnmente para mejorar el proceso fermentativo, los resultados
del presente estudio sugieren que podrían no ser estrictamente necesarios. Las
concentraciones iniciales de
Lactobacillus
en los tratamientos, tanto inoculados como no
inoculados, superaron los valores mínimos recomendados en la literatura (≥3,0 × 10⁵ UFC/g)
(Nair et al., 2020; Holguín et al., 2018a), lo cual les otorgó una ventaja competitiva al momento
de colonizar el silo y conducir una fermentación eficiente.
De forma similar a lo reportado por Nair et al. (2020), donde el ensilaje control no inoculado
(CON) y el ensilaje inoculado (INOC) con 3,0 × 10⁵ UFC/g de bacterias ácido-lácticas,
compuesto por 1,5 × 10⁵ UFC/g de L. hilgardii CNCM I-4785 y 1,5 × 10⁵ UFC/g de
L. buchneri
NCIMB 40788, presentaron valores de pH similares (p > 0.05) durante el proceso de ensilado.
No obstante, después de 14 días de exposición aeróbica, el pH fue significativamente mayor (p
< 0.001) en el tratamiento no inoculado, lo cual evidencia la ventaja del uso de bacterias
heterofermentativas en la mejora de la estabilidad aeróbica del producto final (Nair et al., 2020).
En cada uno de los tratamientos evaluados, al analizar la población de
Lactobacillus
en los
cuatro tiempos de fermentación, se observó que el T1, donde actuó únicamente la flora epífita
del material forrajero, presentó un crecimiento exponencial de estas bacterias a lo largo del
tiempo. En contraste, los tratamientos inoculados mostraron una disminución en la población
microbiana. Esta diferencia podría deberse a que el proceso de fermentación, al desarrollarse
de manera paulatina, permite que las bacterias epífitas tengan más tiempo para adaptar su
metabolismo y establecerse eficientemente (Hutkins y Nannen, 1993). Los resultados obtenidos
en este estudio fueron superiores a los reportados por Filya (2003), quien evaluó ensilajes de
sorgo inoculados con
L. buchneri
y
L. plantarum
, solos y combinados, en diferentes tiempos
de fermentación (2, 4, 8, 15 y 90 días).
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Por otro lado, los principales parámetros para evaluar la calidad del forraje mediante
producción de gas son la tasa de degradación y el volumen máximo alcanzado, ya que reflejan
la eficiencia fermentativa de la muestra (Ramírez-Díaz et al., 2020). Forrajes con tasas elevadas
de producción de gas son más fermentables y digeribles, lo que se traduce en una
fermentación más rápida durante la incubación. En este sentido, durante el primer día de
fermentación, el T1 presentó la mejor tasa de fermentación y una menor duración del periodo
de colonización, alcanzando una producción máxima de gas similar a la de los otros
tratamientos, que requirieron más tiempo para colonizar.
Sin embargo, a los 21 días de fermentación, se observó un cambio importante: el T2 mostró el
mejor comportamiento, con una producción de gas superior a la reportada por Faria et al.
(2010), quienes evaluaron ensilajes de sorgo BRS-610 en siete etapas de maduración mediante
la técnica semiautomática de producción de gas
in vitro
.
Respecto a los parámetros cinéticos, los valores obtenidos para la fracción A fueron inferiores
a los reportados en otros estudios, donde se han documentado fracciones solubles cercanas
al 20% en ensilajes de híbridos de sorgo (Corral-Luna et al., 2011; Villalba, 2013). Sin embargo,
fueron similares a los encontrados por Costa et al. (2016) en ensilajes de sorgo BR-700. Los
valores del parámetro B, que fueron más altos para el T2, representan la fracción insoluble de
la FNDN potencialmente degradable. La digestibilidad del forraje es un aspecto clave para
comparar materiales, ya que influye directamente en el rendimiento y el retorno económico
(Costa et al., 2016). En este contexto, las fracciones A y C resultan especialmente relevantes:
una fracción A elevada indica mayor degradabilidad, mientras que un valor bajo de C refleja
un tiempo más corto para la desaparición de la fracción fácilmente degradable. No obstante,
en este estudio no se observaron diferencias significativas entre tratamientos para estas
fracciones.
Los valores de producción de gas acumulado encontrados por Faria et al. (2010) fueron
inferiores a los de este estudio, indicando en aquel caso un menor tiempo de incubación y una
mayor tasa de colonización en los tratamientos con aditivos de
Lactobacillus
. Esta diferencia
vv
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de ensilaje enriquecido con
Lactobacillus
.
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podría atribuirse a una mayor disponibilidad de carbohidratos solubles y a una mejor calidad
de la fibra, factores que promueven una rápida colonización y degradación del material (Faria
et al., 2010). En línea con esto, Harrison et al. (1994) señalaron que los efectos de los aditivos
sobre la composición del ensilaje dependen del tipo de inoculante, su actividad biológica, la
dosis aplicada (6 × 10⁵ UFC/g), el contenido de materia seca y la composición química del
forraje.
Independientemente del tiempo de fermentación evaluado (1 o 21 días), el T2 produjo un
mayor volumen de gas en comparación con los demás tratamientos. De forma similar, al
relacionar la cantidad de materia seca degradada con el volumen acumulado de gas producido
a las 72 horas de incubación, se comprobó que los tres tratamientos, con y sin aditivos,
presentaron una producción similar de gas por miligramo de sustrato degradado. Esto indica
que la energía contenida en los sustratos fue utilizada de forma eficiente para el crecimiento
microbiano.
Holguín et al. (2021) reportaron que los inoculantes comerciales y las bacterias epífitas no
generaron diferencias en los parámetros de fermentación ni en la producción de gas en
ensilajes, lo que sugiere que esta técnica de evaluación debe complementarse con la medición
de la degradabilidad de la materia seca. Esto se debe a que existen sustratos con alta
degradabilidad que, proporcionalmente, pueden generar menor volumen de gas, pero
presentan un mayor factor de partición, mayor eficiencia en la síntesis de proteína microbiana,
mayor consumo y menor producción de metano (Bezabih y Tamir, 2014; Blümmel et al., 1999).
CONSIDERACIONES FINALES
Los resultados de este estudio permiten concluir que el sorgo dulce (
Sorghum saccharatum
)
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posee una flora epífita capaz de garantizar un adecuado proceso fermentativo y una eficiente
acidificación del material ensilado, incluso sin la adición de inoculantes comerciales. La
inclusión de aditivos a base de
Lactobacillus buchneri
o
Lactobacillus plantarum
no generó
mejoras significativas en los parámetros de fermentación ni en la cinética de degradación del
ensilaje, por lo que su uso no resulta necesario bajo condiciones tropicales similares a las del
presente estudio.
Una de las principales implicaciones prácticas de estos hallazgos es que es posible obtener
ensilajes de buena calidad sin recurrir a inoculantes, siempre que se implementen adecuadas
prácticas de manejo en la elaboración y conservación del material. Esta información resulta
particularmente valiosa para la toma de decisiones a nivel de finca, ya que permite a los
productores optimizar sus recursos sin comprometer la calidad del forraje conservado.
Desde una perspectiva económica, los resultados sugieren que los productores pueden
prescindir del uso de aditivos comerciales sin afectar negativamente el proceso fermentativo,
lo cual representa un ahorro potencial y una alternativa más accesible para sistemas de
producción en regiones tropicales. Asimismo, estos hallazgos invitan a reevaluar la necesidad
de aditivos en contextos donde la materia prima y las condiciones ambientales favorecen una
fermentación espontánea exitosa.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su agradecimiento al Grupo de Investigación en Ciencias Animales
(GRICA) de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Antioquia, así como al
personal asistente del laboratorio por su colaboración en el desarrollo de esta investigación.
De manera especial, se agradece a la M.Sc. Luz Clemencia Fandiño, bacterióloga del
Laboratorio de Diagnóstico Veterinario (LADIVE) de la Facultad de Medicina Veterinaria y de
Ciencias Animales de la Universidad del Tolima, por su valioso apoyo técnico y científico.
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Lactobacillus
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LITERATURA CITADA
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