Abstract

Introduction. Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa L. ssp indica) represents an opportunity for scientific research and genetic improvement. Optimization of the protocol is necessary to obtain the highest transformation efficiency. Objective. To evaluate different factors that affect the genetic transformation in embryogenic rice callus of subspecies indica through Agrobacterium tumefaciens. Materials and methods. This study was performed in San José, Costa Rica between 2012 and 2014. The following were evaluated in six treatments: the effect of callus age, acetosyringone concentration, lighting condition, the presence or absence of radicle, and Agrobacterium tumefaciens strain on the genetic transformation of embryogenic calli of rice variety CR5272 with gus reporter gene. Agrobacterium strains LBA4404 with pCAMBIA1305.2 plasmid, and strains ATHV, GV3101, and LBA4404 with the pCAMBIA 1303 plasmid were compared; by histochemical tests for the detection of transient expression of the β-glucuronidase reporter gene. Results. The evaluation of the six treatments with strain LBA4404::pCAMBIA 1305.2 resulted in transient expression of 1.33-7.00 % of the GusPlus gene for the CR5272 variety, and 8.00 % for the control with the Nipponbare (ssp. japonica) variety. The strains with the pCAMBIA1303 plasmid showed a transient expression of the gusA gene between 100-65 % with an average area of 14.23 mm2 (ATHV), 8.81 mm2 (GV3101), and 8.83 mm2 (LBA4404) with no significant differences between them; however, there were differences when compared with strain LBA4404::pCAMBIA1305.2 (85 %, 4.39 mm2). Conclusions. The use of the conditions: six-day callus, acetosyringone concentration of 76 µM, light before and after cocultivation, presence of radicle and the ATHV::pCAMBIA 1303 , improved the transformation efficiency with Agrobacterium tumefaciens in the rice variety CR5272.

Introducción

La alimentación mundial se ha basado en un alto consumo de cereales como parte de la nutrición básica. Uno de los más importantes es el arroz, el cual representa 20 % del consumo de la energía dietética de la mitad de la población global (Food and Agriculture Organization, 2004; Fukagawa & Ziska, 2019). En Costa Rica, el arroz forma parte importante de la dieta de la población, con un consumo anual per cápita de 46,96 kg (Corporación Arrocera Nacional, 2019).

Estudios realizados por la Organización de las Naciones Unidas (United Nations, 2019), estiman que para 2050, la población mundial estaría cercana a los 9,7 billones, lo que representa un aumento de 30 % en comparación con las cifras del año 2015. Por lo anterior, y debido a la importancia alimenticia y económica del arroz, existe una necesidad de aumentar el rendimiento de este cultivo, en donde la ingeniería genética representa una de las soluciones para la producción de nuevas variedades con características agronómicas deseables (Datta & Datta, 2006).

La modificación mediada por Agrobacterium sp. ha sido, dentro de la ingeniería genética, una de las técnicas preferidas gracias a su eficiencia, ya que produce un bajo número de copias de los transgenes insertados en el genoma hospedero y la heredabilidad de los transgenes, así como una expresión por lo general estable de los genes y fertilidad en las plantas (Bonilla et al., 2008; Kuta &Tripathi, 2005; Opabode, 2006; Patel et al., 2013; Tie et al., 2012).

Este sistema de transformación genética ha sido utilizado desde hace más de dos décadas en arroz (Hiei et al., 1994), para el mejoramiento de características agronómicas importantes en este cereal, entre ellas la resistencia a los insectos Chilo suppressalis, Scirpophaga incertulas y Nilaparvata lugens y tolerancia a situaciones de estrés tales como sequía y salinidad (Cheng et al., 1998; Ramesh et al., 2004; Tan et al., 2017).

Se realizaron varias investigaciones con el objetivo de aumentar la eficiencia de la transformación en variedades de las subespecies japonica (30 % a 100 %) e indica (1,5 a 3,5 %) (Tie et al., 2012). La subespecie indica presenta aún cierta resistencia que disminuye la tasa de transformación por Agrobacterium sp. (Hiei & Komari, 2006; Shri et al., 2013; Tan et al., 2017; Tie et al., 2012), por lo que es necesaria la optimización. Para esto, se debe tomar en cuenta que en la transformación genética con Agrobacterium intervienen múltiples factores, como el genotipo de la planta, el tipo de explante utilizado, la cepa de la bacteria, los genes de selección y las condiciones del cultivo de tejidos como la adición de la acetosiringona, la cual es un componente esencial para lograr una mayor frecuencia de transformación, porque induce los genes vir y se incrementa la actividad de las cepas de Agrobacterium (Deeba et al., 2014; Saharan et al., 2004; Shri et al., 2013).

El empleo de genes marcadores tales como GUS (Jefferson et al., 1986), es útil para determinar la eficiencia de transformación de los protocolos experimentales de transformación genética. Se ha demostrado la presencia ubicua de la enzima β-glucuronidasa en varias plantas modelos, dentro de ellas Oryza sativa, cuya actividad podría alterar los resultados observados de expresión de gus (Sudan et al., 2006); sin embargo, el uso de metanol reduce la interferencia de la actividad enzimática nativa (Abdollahi et al., 2011; Tripathi et al., 2010), lo que posibilita el uso apropiado de la técnica para la observación de la expresión transitoria del gen marcador (Reddy, 2008).

El objetivo de esta investigación fue evaluar diferentes factores que afectan la transformación genética en callos embriogénicos de arroz de la subespecie indica vía Agrobacterium tumefaciens.

Materiales y métodos

Esta investigación se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Aplicada al Mejoramiento Genético de Cultivos del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM) de la Universidad de Costa Rica, en San José, Costa Rica, entre enero del 2012 y diciembre del 2014.

Inducción de callos a partir de embriones zigóticos maduros de arroz

Se utilizó semilla fundación de la variedad comercial de arroz (Oryza sativa L. ssp indica) CR5272 (Camacho & Navarro, 2020; León & Arroyo, 2011; Valdés et al., 1992) de la subespecie indica, donada por el Centro para Investigaciones en Granos y Semillas (CIGRAS) de la Universidad de Costa Rica; como control se utilizó semilla de arroz de la variedad Nipponbare subespecie japonica, donada por el Laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Universidad de Lleida, España. Estas semillas se usaron para la inducción de callos embriogénicos derivados de los embriones zigóticos maduros, que serían el tejido blanco para la transformación con A. tumefaciens.

Las semillas se descascararon mediante tratamiento con papel lija 3M N°100 y se desinfectaron dos veces mediante inmersión en una solución de NaOCl 3,5 % i.a, y Tween 20 (Sigma Aldrich Chem. Co., USA) con agitación constante a 110 revoluciones por minuto (RPM) durante 20 min en un agitador orbital horizontal (Hotech Modelo721). Estas fueron enjuagadas cuatro veces con agua destilada estéril en una cámara de flujo laminar de aire estéril. Luego, las semillas de la variedad CR5272 se sembraron en cajas petri con 20 ml del medio de inducción (MSTP), compuesto por sales minerales (MS) (Murashige & Skoog, 1962), adicionado con 50 mg l-1 triptófano, 500 mg l-1 prolina, 30 g l-1 sacarosa y 2,0 mg l-1 2,4-D. Por su parte, las semillas de Nipponbare se cultivaron en el medio MSP descrito por Bai et al. (2014), compuesto por las sales minerales (MS) (Murashige & Skoog, 1962), suplementado con vitaminas Gamborg’s B5 (M404, PhytoTech lab) y 300 mg l-1 caseína hidrolizada, 500 mg l-1 prolina, 2,5 mg l-1 de 2,4-D y 20 g l-1 sacarosa. Se utilizaron reactivos sintetizados por Phytotechnology Lab (USA). El pH de los medios MSTP y MSP se ajustó a 5,8 antes de la adición del agente gelificante (3 g l-1 y 5 g l-1 de phytagel, respectivamente), esterilizándose en autoclave a 121 ºC durante 20 min. Los cultivos se incubaron en condiciones de oscuridad continua a una temperatura promedio de 26 ºC.

Cepas de Agrobacterium tumefaciens

Se utilizaron las cepas de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Ach5, octopina), ATHV y GV3101 (C58, nopalina), transformadas con los vectores binarios pCAMBIA 1305.2 (https://www.snapgene.com/resources/plasmidfiles/?set=plant_vectors&plasmid=pCAMBIA1305.2) y pCAMBIA 1303 (https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=plant_vectors&plasmid=pCAMBIA1303), con base en el protocolo de Reddy (2008) y Tzfira et al. (1997). Estos plásmidos contienen el promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV35s), el gen de la higromicina fosfotransferasa II (hptII) que confiere resistencia a la higromicina B, el gen nptII de resistencia a la kanamicina, el gen marcador GusPlus y gusA, así como el terminador nos.

Se inocularon 50 µl de la suspensión de bacterias y distribuyeron con ayuda de una espátula drigalsky estéril sobre el medio de crecimiento semisólido YEM, colocado en placas petri (0,4 g l-1 de extracto de levadura, 10,0 g l-1 de manitol, 0,1 g l-1 de NaCl, 0,2 g l-1 de MgSO4, 0,5 g l-1 de K2HPO4, pH a 7,0 y 15,0 g l-1 de agar suplementado con 50 mg l-1 de kanamicina (BP861, Sigma-Aldrich®). Las placas de petri inoculadas se colocaron a 28 ºC por 24 h. Se extrajo el ADN del plásmido de las colonias con el kit para miniprep GeneJet™ (K0503, Thermo Fischer Scientific). Luego, se realizó una reacción de amplificación en cadena (PCR) para el gen hptII con el ADN extraído para confirmar la presencia de los plásmidos de la siguiente manera: 2,0 µl de ADN (10 ng µl-1), 12,55 µl de H2O, 2,0 µl de Buffer (10X (NH4)2SO4), 1,2 µl de MgCl2 (25 mM), 0,4 µl de dNTPs (10 mM), 0,4 µl de primer hptII FW (5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGA-3’) 20 µM, 0,4 µl de primer hptII RV (5’-TCCATCACAGTTTGCCAGTGATACA-3’) 20 µM, 0,8 µl de BSA (10 mg ml-1), 0,25 µl de ADN Taq polimerasa (5 U µl-1). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 5 min a 94 ºC seguido de 35 ciclos (1 min a 94 ºC, 1 min 69 ºC y 1 min a 72 ºC); se finalizó con 10 min a 72 ºC. Además, se incluyó agua como control negativo y una muestra de ADN de los plásmidos purificados como control positivo. Se utilizó un gel de agarosa al 1 % (p/v) con buffer TAE 1 % (v/v) a 60 V durante 1 h para la evaluación de los productos de PCR.

Transformación de arroz mediada por Agrobacterium

Se multiplicó la cepa de Agrobacterium LBA4404 con el plásmido pCAMBIA1305.2 un día antes de utilizarla para la modificación del arroz. Para ello, la bacteria se incubó en 100 ml de medio YEM adicionado con 50 mg l-1 de kanamicina a 28 ºC en agitación a 200 rpm (Agitador Hotech Instruments Corp, modelo 902) en oscuridad por un día. La bacteria se dejó crecer hasta que alcanzó una densidad óptica (DO600) de 0,5, que se midió con un espectrofotómetro (Thermo Scientific). La suspensión de bacterias se centrifugó a 5000 rpm por 10 min a 4 ºC, se descartó el medio y se recuperaron las células en 100 ml de medio AAM (Toriyama & Hinata, 1985), suplementado con acetosiringona (Sigma; D134406, la concentración de este reactivo varió según el tratamiento que se iba a evaluar) y se colocaron en crecimiento a 28 ºC con agitación a 200 rpm en oscuridad por 1 h.

Se evaluaron seis tratamientos de transformación de arroz con Agrobacterium, los cuales se describen en el Cuadro 1. Los tratamientos fueron los siguientes: T01: 5272-10-[76]-Osc-SR (este tratamiento corresponde al protocolo descrito por Reddy (2008); T02: 5272-6-[76]-Osc-SR; T03: 5272-6-[76]-Luz-CR; T04: 5272-6-[76]-Luz-SR; T05: 5272-6-[150]-Luz-SR; T06: 5272-6-[300]-Luz-SR. Se realizó un experimento control con la variedad de arroz Nipponbare, con las condiciones descritas por Reddy (2008) para evaluar la efectividad del protocolo y funcionalidad de la cepa LBA4404 con el plásmido pCAMBIA1305.2 y un control (no tratamiento de callos) sin transformar. Cada experimento de transformación se realizó por triplicado. Para cada réplica se utilizaron 150 callos de arroz, de los cuales 100 callos se transformaron con la cepa respectiva y el resto se mantuvieron como control sin transformar.

Cuadro 1 Descripción de los tratamientos de transformación de arroz con Agrobacterium tumefaciens. Laboratorio de Biotecnología Aplicada al Mejoramiento Genético de Cultivos del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. 2012 - 2014. Table 1. Description of rice transformation treatments with Agrobacterium tumefaciens. Laboratory of Applied Biotechnology to Crop Genetic Improvement of the Centro de Investigacion en Biologia Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San Jose, Costa Rica. 2012 - 2014. Cuadro 1 Descripción de los tratamientos de transformación de arroz con Agrobacterium tumefaciens. Laboratorio de Biotecnología Aplicada al Mejoramiento Genético de Cultivos del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. 2012 - 2014.

Para realizar la transformación genética, se utilizó el siguiente procedimiento: finalizada la fase de inducción de callo embriogénico, se eliminó la radícula para los tratamientos “SR”. Los callos se sumergieron en 45 ml de la suspensión de A. tumefaciens en medio AAM, se colocaron en agitación (15 rpm) durante 15 min. Se sacaron los callos de la solución y se eliminó el exceso de bacteria, luego se colocaron sobre papel filtro (Whatman #2) estéril. Se co-cultivaron sobre un nuevo papel filtro (9 cm de diámetro), humedecido con 0,5 ml de medio AAM, suplementado con la concentración indicada de acetosiringona. Estos filtros se colocaron sobre medio MSTP, suplementado con 10 g l-1 de glucosa y acetosiringona de acuerdo con el tratamiento. Transcurridos tres días de cocultivo a 26 ºC, se lavaron los callos cinco veces en agua destilada estéril y una vez con agua destilada estéril con un volumen de 500 mg l-1 de carbenicilina (Phytotechnology Laboratories, C346), para eliminar la bacteria. Se secó el exceso de humedad con papel filtro esterilizado.

Para confirmar que el gen gus del plásmido pCAMBIA1305.2 se expresaba de forma correcta, se realizó una transformación con el método de biolística como control. Para esto, se transformaron 20 callos de seis días de edad de la variedad CR5272 en tres repeticiones. Estos se colocaron en medio osmótico MSO durante 4 h antes del bombardeo. El medio está compuesto por las sales minerales Murashige & Skoog (1962) (MS), 30 de g l-1 de maltosa, 2 mg l-1 de 2,4-D, 47 g l-1 de sorbitol, 47 g l-1 de manitol, pH de 5,8 y 3 g l-1 de Phytagel. Se esterilizó en autoclave a 121 ºC por 20 min.

Se utilizó el plásmido pCAMBIA1305.2 purificado de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Para la transformación de los callos, se tomaron 5 µg del plásmido y se mezclaron con 50 µl de una suspensión de oro estéril (1,0 µm de diámetro, BIORAD) a 60 mg ml-1, 20 µl de espermidina (PhytoTechnology Laboratories, S837) 0,1 M, 50 µl de CaCl2 (Sigma, C-3881) 2,5 M se agitó de forma constante en un vórtex. La mezcla se dejó reposar a 25 °C por 10 min y luego se centrifugó por 10 s a 10000 rpm. Se eliminó el sobrenadante con la pipeta sin tocar el botón. Luego, se agregaron 50 µl de etanol absoluto y de inmediato se pipetearon 9 µl de la solución sobre las membranas macroacarreadoras. Se dejaron secar las partículas con la colocación de la membrana en placas Petri con sílica gel durante 10 min. El disparo se realizó con helio a una presión de 1100 psi con el sistema de biolística (BIORAD modelo PDS-1000/He) (García-Arias, 2011). Luego, los callos se cultivaron en el medio osmótico MSO durante 24 h y se transfirieron al medio MSTP, se incubaron en condiciones de oscuridad y 25 ºC de temperatura .

Evaluación del protocolo obtenido con otras cepas de Agrobacterium

Se realizaron dos experimentos de transformación con las condiciones que brindaron los mejores resultados en el apartado anterior, las cuales fueron: variedad CR5272, callos de seis días de edad, acetosiringona 76 µM, utilización de luz durante la fase de inducción y posterior al cocultivo, y presencia de radícula durante el proceso de transformación. Se utilizaron las cepas de Agrobacterium LBA4404, ATHV, GV3101 transformadas con el plásmido pCAMBIA1303, debido a que esta combinación de cepas plásmido se utiliza en forma rutinaria en otros laboratorios y con otros cultivos, adicionalmente, se utilizó la combinación cepa LBA4404 con el plásmido pCAMBIA 1305.2 como control, con el objetivo de comparar la eficiencia de transformación del mismo protocolo, pero con diferentes cepas de Agrobacterium y plásmido distinto. Se transformaron veinte callos embriogénicos por cepa y se sustituyó el medio de cultivo MSTP por MSP.

Evaluación de la expresión del gen gus

Para determinar la expresión de los genes GusPlus y gusA, se utilizó el kit β–Glucuronidase Reporter Gene Staining (Sigma, GUS) y se les realizó una aplicación de metanol al 20 %; todas las coloraciones azules que se observaron en los callos se consideraron como expresiones transitorias del gen (Abdollahi et al., 2011; Kosugi et al., 1990; Tripathi et al., 2010). Posterior a la tinción, los callos embriogénicos transformados y los controles se almacenaron en tubos de 1,5 ml con alcohol al 75 %.

Este tipo de evaluación es un método simple y sensitivo para detectar la actividad del gen un día después de la transformación y, aunque no es necesario que los transgenes se encuentran integrados de forma estable en el genoma vegetal, es posible inferir la eficiencia de las condiciones experimentales y protocolos de transformación (Bonilla et al., 2008; Cervera, 2005; He et al., 2005; Ramesh & Gupta, 2005).

La prueba se aplicó de la siguiente manera: en los experimentos de transformación con Agrobacterium (T0 a T06) y en el control con biolística, se contó el número de callos con puntos de color azul como indicador de la expresión transitoria del gen GusPlus y se expresaron los resultados en términos del porcentaje del total de callos que muestran coloración azul. Se analizaron veinte callos del control negativo (control - no tratamiento) y cincuenta callos transformados de cada una de las repeticiones de los experimentos con Agrobacterium. En el experimento de biolística se evaluaron diez callos transformados y diez callos del control (no tratamiento en cada una de las repeticiones). En los experimentos con diferentes cepas de Agrobacterium (LBA4404, ATHV, GV3101), se evaluó la expresión transitoria de los genes gusA y GusPlus, se midió el área de color azul presente en los callos transformados con el programa ImageJ (versión 1.50i) (Schneider et al., 2012).

Análisis estadístico de los datos

Los datos obtenidos se analizaron con el paquete estadístico R (R Core Team, 2015). En la primera serie de mediciones se analizó el número de callos que muestran una tinción azul con regresión logística. Los resultados de las pruebas realizadas se ajustaron para comparaciones múltiples con el método de Tukey (P<0,05).

En la segunda etapa, los datos del área de los callos que mostraron tinción positiva para cada una de las cepas estudiadas, se compararon con un análisis de varianza de una vía con la raíz cuadrada de la variable de respuesta, seguido de la prueba de Tukey (P<0,05) para comparar todos los posibles pares de tratamiento.

Resultados

Evaluación de la transformación de arroz con la cepa LBA4404::pCAMBIA1305.2

Para determinar las mejores condiciones de transformación genética del arroz con Agrobacterium tumefaciens LBA4404::pCAMBIA1305.2, se evaluaron las siguientes variables: variedad de arroz, edad de los callos, concentración de acetosiringona, condición lumínica y presencia o ausencia de radícula (T01: 5272-10-[76]-Osc-SR; T02: 5272-6-[76]-Osc-SR; T03: 5272-6-[76]-Luz-CR; T04: 5272-6-[76]-Luz-SR; T05: 5272-6-[150]-Luz-SR; T06: 5272-6-[300]-Luz-SR).

Al realizar el análisis de los resultados (Figura 1), se detectaron diferencias significativas en la expresión transitoria del gen GusPlus entre los tratamientos T01 (0,59 % de los callos con expresión transitoria) vs T03 (7,00 %), T01 (0,59 %) vs Control - Nipponbare (8,00 %) y T06 (1,33 %) vs Control - Nipponbare (8,00 %). Asimismo, se observaron algunas tendencias relacionadas con la edad del callo, la utilización de la luz, la presencia de la radícula y el genotipo del arroz.

Figura 1 Efecto de los tratamientos de transformación con Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404::pCAMBIA1305.2 sobre la expresión transitoria del gen GusPlus. Los valores muestran la eficiencia promedio de transfección ± SEM (nControl Neg=500, nControl Nipp= 150, nT01= 170, nT02= 150, nT03= 100, nT04= 150, nT05= 150, nT06= 150). Laboratorio de Biotecnología Aplicada al Mejoramiento Genético de Cultivos del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. 2012 - 2014. Figure 1. Effect of transformation treatments with Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404:: pCAMBIA1305.2 on the transient expression of the GusPlus gene. The values show mean transfection efficiency ± SEM (nControl Neg=500, nT01= 170, nControl Nipp= 150, nT02= 150, nT03= 100, nT04= 150, nT05= 150, nT06= 150). Laboratory of Applied Biotechnology to Crop Genetic Improvement of the Centro de Investigación en Biologia Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San Jose, Costa Rica. 2012 - 2014. Figura 1 Efecto de los tratamientos de transformación con Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404::pCAMBIA1305.2 sobre la expresión transitoria del gen GusPlus. Los valores muestran la eficiencia promedio de transfección ± SEM (nControl Neg=500, nControl Nipp= 150, nT01= 170, nT02= 150, nT03= 100, nT04= 150, nT05= 150, nT06= 150). Laboratorio de Biotecnología Aplicada al Mejoramiento Genético de Cultivos del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. 2012 - 2014.

El porcentaje de expresión transitoria del gen GusPlus promedio obtenido en el tratamiento T01 con callos de diez días de edad fue 0,59 %. Sin embargo, se observó un leve incremento al utilizar callos de seis días de edad en el tratamiento T02 (3,33 %). Al comparar los tratamientos T02 y T04, en los cuales se varió la condición lumínica durante la fase de inducción de callos embriogénicos a partir de semilla madura, se obtuvo el mismo porcentaje con ambos tratamientos (3,33 %). En el tratamiento T03, en el que no solo se utilizó la inducción del callo con luz, sino que se mantuvo la radícula en el callo, la expresión transitoria del gen fue de 7,00 %.

Los resultados obtenidos en esta investigación indican un posible efecto de la concentración de acetosiringona sobre la expresión transitoria del gen GusPlus. En los tratamientos T04, T05 y T06, en los que se usó 76, 150 o 300 µM de acetosiringona, respectivamente, se observó un porcentaje de expresión del gen GusPlus de 3,33 %, 5,33 % y 1,33 %, respectivamente. Esto sugiere que una concentración de 150 µM de este reactivo estuvo asociado con una mayor expresión transitoria del GusPlus.

La expresión del gen GusPlus en el tratamiento control con la variedad Nipponbare fue de un 8 %, la mayor que se obtuvo para la transformación con Agrobacterium tumefaciens LBA4404::pCAMBIA1305.2. Las condiciones utilizadas para el control, brindaron los resultados esperados: ningún callo del control mostró expresión del gen GusPlus y todos los callos transformados con el método de biolística presentaron tinción (Figura 2).

Figura 2 Expresión transitoria del gen GusPlus en callos embriogénicos de arroz (Oryza sativa) variedad CR5272 de la subespecie indica. A, B y C: control. D, E y F: callos transformados con Agrobacterium LBA4404 (pCAMBIA 1305.2) tratamientos T05, T03, y T02; respectivamente. G, H e I: callos transformados con el método de biolística con el plásmido pCAMBIA 1305.2. Laboratorio de Biotecnología Aplicada al Mejoramiento Genético de Cultivos del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. 2012 – 2014. Figure 2. Transient expression of the GusPlus gene in rice (Oryza sativa) embryogenic calluses (Oryza sativa) variety CR5272 of the subspecies indica. A, B, and C: Control. D, E, and F: Callus transformed with Agrobacterium LBA4404 (pCAMBIA 1305.2) treatments T05, T03, and T02, respectively. G, H, and I: Calluses transformed with the biolistics method with the plasmid pCAMBIA 1305.2. Laboratory of Applied Biotechnology to Crop Genetic Improvement of Centro de Investigacion en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San Jose, Costa Rica. 2012 - 2014. Figura 2 Expresión transitoria del gen GusPlus en callos embriogénicos de arroz (Oryza sativa) variedad CR5272 de la subespecie indica. A, B y C: control. D, E y F: callos transformados con Agrobacterium LBA4404 (pCAMBIA 1305.2) tratamientos T05, T03, y T02; respectivamente. G, H e I: callos transformados con el método de biolística con el plásmido pCAMBIA 1305.2. Laboratorio de Biotecnología Aplicada al Mejoramiento Genético de Cultivos del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. 2012 – 2014.

Evaluación del protocolo obtenido con otras cepas de Agrobacterium

Al evaluar el protocolo obtenido en la primera parte con las cepas de Agrobacterium ATHV::pCAMBIA1303, GV3101::pCAMBIA1303, LBA4404::pCAMBIA1303 y LBA4404::pCAMBIA1305.2, la expresión transitoria de los genes gusA y GusPlus varió entre el 65 y 100 %, mientras que el área promedio de expresión transitoria osciló entre 4,4 mm2 y 14,2 mm2 (Cuadro 2).

Cuadro 2 Porcentaje y área de callos embriogénicos de arroz (Oryza sativa) variedad CR5272 con expresión transitoria del gen gus por cepa de Agrobacterium evaluada. Laboratorio de Biotecnología Aplicada al Mejoramiento Genético de Cultivos del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. 2012 – 2014. Table 2. Percentage and area of rice (Oryza sativa) embryogenic callus variety CR5272 with transient expression of the gus gene per Agrobacterium strain evaluated. Laboratory of Applied Biotechnology to Crop Genetic Improvement of the Centro de Investigacion en Biologia Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San Jose, Costa Rica. 2012 – 2014. Cuadro 2 Porcentaje y área de callos embriogénicos de arroz (Oryza sativa) variedad CR5272 con expresión transitoria del gen gus por cepa de Agrobacterium evaluada. Laboratorio de Biotecnología Aplicada al Mejoramiento Genético de Cultivos del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. 2012 – 2014.

Se observaron diferencias significativas en el área promedio de expresión transitoria del gen gus entre las diferentes cepas (p= 1,03e-05). Al realizar el análisis por comparaciones múltiples (Cuadro 2), las cepas ATHV::pCAMBIA1303, GV3101::pCAMBIA1303, LBA4404::pCAMBIA1303, no presentaron diferencias entre sí (p>0,05). La cepa LBA4404::pCAMBIA1305.2 presentó diferencias al ser comparada con el resto de las cepas evaluadas (p<0,05) (Cuadro 2).

Discusión

La transformación del arroz con Agrobacterium tumefaciens está supeditada a varios factores que median su éxito. La presente investigación evidenció que la edad del callo es un factor primordial que influyó en la eficiencia de transformación del arroz. En la variedad CR5272 esto puede explicarse por la presencia de una delgada capa de nueve a doce filas de células pequeñas e isodiamétricas con alta actividad mitótica a partir de los tres días durante la fase de inducción del callo (Vega et al., 2009), lo que es probable que las haga más sensibles a la transformación con la bacteria y, por ende, muestran una mayor expresión transitoria del gen gus. Mientras que, a partir de los diez días de inducción, se presentó un aumento inmediato en el tamaño de las células del callo y se dio una agrupación con diferentes estados de diferenciación (Vega et al., 2009). Es probable que este estado, así como el espesor de las células, dificulten la capacidad de penetración del Agrobacterium, lo que se traduce en una menor eficiencia de transformación para esta variedad.

Los resultados de eficiencia de transformación dependiente de la edad de los callos, podrían estar también relacionados al genotipo, en este caso en forma muy específica con la variedad CR5272 utilizada en esta investigación, ya que se ha reportado en otras variedades de la subespecie indica como la IR64 e IR72 que callos derivados de embriones zigóticos de ocho semanas de edad tuvieron una mayor eficiencia de transformación, aunado a que eran más friables y presentaron menor oxidación durante la transformación (Kumar et al., 2005). Asimismo, los callos embriogénicos de la variedad indica Ratnagiri-711 de 35 días de edad obtuvieron eficiencia de transformación de 34,03 %, mientras que al utilizar callos de veinticinco días se dio una reducción considerable en la eficiencia de la transformación 8,86 % (Sawant et al., 2018). En otro caso, se utilizó la variedad ASD16, en donde fueron los callos de veintiún días de edad los que mostraron mayor frecuencia de transformación, en contraste con los callos de catorce días (Sundararajan et al., 2017).

Este estudio evidencia un efecto de la concentración de la acetosiringona sobre la eficiencia de transformación con Agrobacterium, ya que al duplicar la concentración de 76 µM a 150 µM se incrementó la expresión transitoria del gen GusPlus pero decayó al utilizar la concentración de 300 µM. Los datos obtenidos concordaron con los observados en otras investigaciones, en los que al aumentar la concentración de acetosiringona (400µM) se incrementó la expresión de un gen marcador, pero decayó al utilizar 500µM (Saharan et al., 2004), así también, en otras investigaciónes, se reportó un aumento en la eficiencia de transformación al utilizar concentraciones de acetosiringona hasta 200 µM (Hoque et al., 2005; Shri et al., 2013).

Con respecto al efecto de la aplicación de luz, los resultados de la presente investigación fueron similares a los obtenidos en la subespecie japonica y en las variedades de la subespecie indica IR-64, Lalat y IET-4786, en donde la aplicación de luz contínua durante todas las fases del cultivo in vitro, excepto durante el cocultivo, ayudó a la obtención de callos óptimos para la transformación con Agrobacterium y tuvo un efecto positivo en la eficiencia de transformación (Nishimura et al., 2006; Shri et al., 2013; Toki, 1997).

La presencia de la radícula permitió la obtención de una mayor expresión transitoria del gen GusPlus; es probable que esto se deba a que al mantenerla se disminuye la manipulación al callo, por lo tanto, existe un menor estrés oxidativo, que se puede presentar cuando hay daño en las células, debido a que se da una mezcla del contenido de las vacuolas y el citoplasma, lo que libera compuestos fenólicos que luego pueden ser oxidados por las enzimas peroxidasa o la polifenol oxidasa, lo que conlleva a una muerte celular (Saikat & Aryadeep, 2019).

El tratamiento control de transformación con Agrobacterium en la variedad Nipponbare, que se usó como tratamiento de referencia, presentó un mayor porcentaje en la expresión transitoria del gen marcador GusPlus al compararse con los demás tratamientos realizados en la variedad CR5272. Los resultados aquí obtenidos concordaron con otras investigaciones que reportaron una mayor eficiencia de la transformación de variedades de la subespecie japonica que variedades de la subespecie indica, las cuales son consideradas recalcitrantes al cultivo in vitro (Kumar et al., 2005; Lin & Zhang, 2005; Nishimura et al., 2006; Yookongkaew et al., 2007). Se ha demostrado que Agrobacterium tiene una menor habilidad para infectar callos de la subespecie indica (var. Zhenshan) en comparación con la subespecie japonica (var. Nipponbare) y se adjudica a las diferencias que presentan en la expresión de los genes relacionados a la defensa en las plantas, multiplicación y división celular, así como los genes relacionados con la replicación del ADN, entre otros (Tie et al., 2012). Los genes relacionados con la defensa de la planta a la infección por Agrobacterium se activan y aumentan en la variedad de la subespecie indica, mientras que en los callos de la variedad Nipponbare, solo algunos genes fueron activados o inclusive fueron reprimidos, lo que permitió una mejor infección por Agrobacterium. Por otro lado, genes relacionados con el crecimiento celular y replicación del ADN se reprimieron en la variedad de la subespecie indica, mientras que esto no ocurrió en la variedad de la subespecie japonica (Tie et al., 2012).

La expresión transitoria del gen GusPlus del plásmido pCAMBIA1305.2 en el experimento control de transformación con biolística, fue del 100 % en todos los callos transformados. Por esta razón, los resultados obtenidos con biolística funcionaron como un control adicional para comprobar la expresión correcta de los genes codificados por el plásmido (Dai et al., 2001).

Los porcentajes de transformación obtenidos con Agrobacterium fueron menores que para el control que se realizó con biolística. No obstante, el interés de trabajar con la transformación mediada por esta bacteria, parte de la importancia de contar con una metodología que ofrece ventajas como el bajo número de copias de transgenes, contar con un modelo más predecible de la integración en el ADN, una mayor probabilidad de que la copia del gen de interés esté intacta, mayor probabilidad de obtener fertilidad en las plantas transformadas y una menor probabilidad de que se presenten quimeras en la planta regenerada (Dai et al., 2001; Sood et al., 2011). Desde el punto de vista económico y científico, es una técnica de menor costo en comparación con biolística, que aunque presenta ventajas documentadas en la literatura, también puede presentar algunas desventajas como: integración parcial de los transgenes o rearreglos, múltiples copias de transgenes en un solo locus, lo que podría resultar en la no expresión del gen o en el silenciamiento de los genes, una menor fertilidad en las plantas transformadas y un mayor costo (i.e. partículas de oro, helio, accesorios e instrumentación, entre otros) (Alok et al., 2017; Dai et al., 2001; Sood et al., 2011).

En este estudio se observó que la cepa de Agrobacterium fue un factor de mayor influencia en la eficacia de transformación, así como el medio de cultivo utilizado al cambiar de MSTP a MSP, ya que se logró un aumento al pasar de un 7 % de expresión transitoria del gen GusPlus a un 85 % de expresión transitoria con la cepa LBA4404::pCAMBIA1305.2. Los resultados indicaron que se obtuvo mayor área de expresión transitoria con las cepas ATHV::pCAMBIA1303 y GV3101::pCAMBIA1303, en comparación con la cepa LBA4404::pCAMBIA1305.2. Esto podría deberse a que cada una de las cepas presentan diferencias en su ADN cromosomal o en el plásmido Ti (Deeba et al., 2014), lo que podría crear un efecto distinto en la expresión transitoria del gen gus en la variedad CR5272.

Conclusiones

Esta investigación permitió evaluar factores que afectaron la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens, en callos embriogénicos de arroz de la variedad costarricense CR5272 de la subespecie indica. Se identificaron las condiciones a partir de las cuales se obtuvo la mayor eficiencia de transformación, que fueron las siguientes: callos de seis días de edad, acetosiringona (76µM), condición de luminosidad (luz continua en todo momento excepto durante el cocultivo con Agrobacterium), presencia de radícula y ATHV como cepa de la bacteria con el plásmido pCAMBIA1303.

Los resultados obtenidos en este estudio ofrecen información necesaria y pueden ser una guía para el diseño de experimentos de transformación para laboratorios con interés de incursionar en la utilización de esta técnica en el mejoramiento genético de arroz tipo indica.