Palabras clave
RHBV
NS3
polyclonal antibodies
immunoelectron microscopy
virus hoja blanca
arroz
RHBV
NS3
anticuerpos policlonales
inmunoelectro microscopia
Cómo citar
Resumen
El gen que codifica por la proteína no estructural NS3 del virus de la hoja blanca de arroz (RHBV) se fusionó al extremo carboxilo del gen de la glutationa-S-transferasa y se expresó en la cepa JM83 de Escherichia coli. Se obtuvieron altas concentraciones de la proteína de fusion (GST-NS3) en forma insoluble. La proteína de fusión se fraccionó en geles de SDS-PAGE, se purificó por electroelución, y se utilizó para producir anticuerpos policlonales en conejo . El antisuero producido se absorbió con extractos crudos de E. coli. Extractos crudos de plantas de arroz sanas e infectadas con el RHBV se evaluaron por Western blots detectándose una banda de peso molecular similar al estimado para la proteína NS3 (23KDa) en las plantas infectadas con el virus. Los tejidos provenientes de plantas infectadas con el RHBV se analizaron por medio de microscopia inmunoelectrónica con oro colloidal marcado con anticuerpos contra la proteína NS3 y la nucleoproteína viral N. Se observó una acumulación in situ de la proteína NS3 en el citoplasma, pero no se detectó en los cuerpos de inclusion, vacuolas o cloroplastos. Se demostró que la proteína NS3 sigue el mismo patron de distribución que el de la nucleoproteína viral N del RHBVCitas
Amann, E., J. Brosius & M. Ptashne. 1983. Vectors bearing a hybrid trp-lac promoter useful for regulated expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene 25: 167-178.
Citovsky, V. & P. Zambrisky. 1995. Transport of nucleic acids through membrane channels: snaking through small holes. Ann. Rev. Microbiol. 47: 167-197.
de Miranda, J., M. Hernández, R. Hull & A. Espinoza. 1994. Sequence analysis of rice hoja blanca virus RNA-3. J. Gen. Virol. 75: 2127-2132
de Miranda, J., R. Hull & A.M. Espinoza. 1995. Sequence of the PV2 gene of rice hoja blanca tenuivirus RNA- 2. Virus Genes10: 205-209.
de Miranda, J., M. Muñoz, R. Wu & A.M. Espinoza. 1996. Sequence of the Rice hoja blanca tenuivirus RNA-2. Virus Genes 12: 231: 237.
Dean P. 1991. Affinity chromatography: a practical approach. IRL. Oxford. 213 p.
Espinoza, A.M., M. Hernández, R. Pereira, B. Falk & V. Medina. 1992. In situ immunogold labeling analysis of the Rice hoja blanca virus nucleoprotein and major non-capsid protein. Virology 191: 619-127.
Espinoza, A.M., R. Pereira, A., Macaya-Lizano, M. Hernández, M. Goulden & C. Rivera. 1993. Comparative light and electron microscopic analyses of tenuivirus major non-capsid protein (NCP) inclusion bodies in infected plants and of the NCP in vitro. Virology 195: 156-166.
Huiet, L., V. Klaassen, J. Tsai & B. Falk. 1991. Nucleotide sequence and RNA hybridization analyses reveal an ambisense coding strategy for maize stripe virus RNA3. Virology 182: 47-53.
Jennings, P. 1963. Estimating yield loss in rice caused by hoja blanca. Phytopathology 53: 492.
Kakutani, T., Y. Hayano, T. Hayashi & Y. Minobe. 1991. Ambisense segment 3 of rice stripe virus: the first instance of a virus containing two ambisense segments. J. Gen. Virol. 72: 465-468.
Laemmli, U. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
Lucas, W. & R. Gilbertson. 1994. Plasmodesmata in relation to viral movement within leaf tissues. Annu. Rev. Phytopathol. 32: 387-411.
Marston, F. 1987. The Purification of eukaryotic polypeptides expressed in Escherichia coli. In D.M. Glover (ed.). DNA cloning: a Practical approach. Volume III. IRL, Oxford.
Nault, L. & E. Ammar. 1989. Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses. Annual Review of Entomology 34: 503-529.
Nguyen, M., B. Ramírez, R. Goldbach & A. Haenni. 1997. Characterization of the in vitro activity of the RNAdependent RNA polymerase associated with the ribonucleoproteins of rice hoja blanca tenuivirus. J. Gen. Virol. 71: 2621-2627.
Ramírez, B., G. Macaya, L. Calvert & A. Haenni. 1992. Rice hoja blanca virus genome. Characterization and expression in vitro. J. Gen. Virol. 73: 1457-1464.
Ramírez, B. & A. Haenni. 1994. Molecular biology of tenuiviruses, a remarkable group of plant virases J. Gen. Virol 75: 467-475.
Ramírez, B., I. Lozano, L. Constanino, A. Haenni & L. Calvert. 1993. Complete nucleotide sequence and coding strategy of rice hoja blanca virus RNA-4. J. Gen. Virol. 74: 2463-2468.
Sambrook, J., E. Fritsch & T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, vol 3 pp. 17.3-17.42.
Schoumacher, F., C. Erny, A. Verna, T. Godefroy-Colburn & C. Stussi-Garaud. 1992. Nucleic acid binding properties of the alfalfa mosaic virus protein produced in yeast. Virology 188: 896-899.
Smith, D. & L. Corcoran. 1992. Expression and purification of glutathione-S-transferase fusio N-proteins, pp. 16.7.1-16.7.8. In F. Ausubel, R., Brent, R. Kingston, D. Moore, J. Seidman, J. Smith & K. Struhl (eds). Current Protocols in Molecular Biology, vol II. 6th. John Wiley (ed.). New York.
Smith, D., K. Daver, P. Board, W. Tiu, E. García & G. Mitchell. 1986. Mr 26000 antigen of Schistosoma japonicum recognized by resistant WEHI 129/J mice is a parasite Glutatione S-transferase. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 38: 8703-8707.
Smith, D. & K. Johnson. 1988. Single step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with Glutatione S-transferase. Gene 67: 31-40.
Thomas, C. & A. Maule. 1995. Identification of the cauliflower mosaic virus movement protein RNA-binding domains. Virology 206: 1145-1149.
Toriyama S., M.Takahashi, Y. Sano & T. Shimizu. 1994. Nucleotide sequence of RNA-1, the largest genomic segment of rice stripe virus, the prototype of the tenuiviruses. J. Gen. Virol. 75: 3569-3579.
Volkin, D. & A. Klibanov. 1989. Minimizing protein inactivation, pp. 1-24. In T.E. Creighton (ed.). Protein function: a practical approach. IRL, Oxford University, Oxford, England.
Comentarios
Esta obra está bajo una licencia internacional Creative Commons Atribución 4.0.
Derechos de autor 2004 Revista de Biología Tropical