Abstract

Introduction. Phenolic acids belong to the group of phenolic compounds, their synthesis and concentration in plants increases when they are under biotic or abiotic stress conditions. Objective. To evaluate the effect of phenolic acids on the enzymatic and non-enzymatic antioxidant defense system in tomato plants subjected to biotic stress. Materials and methods. The experiment was carried out from March to December 2016, in Saltillo, Mexico. A tomate crop Saladette type of the Rio Fuego variety (Solanum lycopersicum Mill.) was stablished. Tomato plants inoculated with Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (1X105 CFU ml-1) were foliar sprayed with phenolic acids at a dose of 1 kg ha-1 with the Defens Gr® product (IA: phenolic acids 10 000 ppm). Leaves were sampled at 15, 31, and 92 days after the transplantation (ddt) and fruits at 90 ddt. Six treatments were used: 1) absolute control (T0), 2) application of phenolic acids before the inoculation with Clavibacter (AFA), 3) application of phenolic acids after inoculation with Clavibacter (AFD), 4) application of phenolic acids before and after inoculation with Clavibacter (AFAD), 5) only application of phenolic acids (AF), and 6) only inoculation with Clavibacter (Cmm). Results. The application of phenolic acids intervened in the activity of enzymatic and non-enzymatic antioxidants. A higher antioxidant capacity was found in leaf than in fruit, which was determined by ABTS (2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid)) and DPPH (1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil). The inoculation of tomato plants increased the activity of catalase and phenylalanine ammonium lyase enzymes in leaf; in addition, there was reduction of superoxide dismutase enzyme activity and total phenol content. Conclusion. Phenolic acids intervened in the enzymatic defense mechanisms of the plant and reduced the stress levels caused by inoculation.

Introducción

El tomate (Solanum lycopersicum Mill.) es un cultivo de importancia económica que se encuentra en todo el mundo. México ocupa el décimo lugar como productor de esta hortaliza (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera, 2017). Sin embargo, los patógenos bacterianos reducen el rendimiento, la bacteria Gram positiva Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) causa la marchitez y cancro bacteriano, las dos enfermedades más importantes en tomate (Gartemann et al., 2003). El grado de afectación por el cancro bacteriano puede ser de hasta un 100 % (Rueda-Barrientos et al., 2017).

Debido a la resistencia que los microorganismos han desarrollado a los antibióticos, se han buscado nuevos compuestos con capacidad de inhibir el desarrollo de patógenos (Daferera et al., 2003). Existen reportes del uso de compuestos fenólicos como inhibidores de Botrytis cinerea (Mendoza et al., 2013) o contra Xylella fastidiosa en condiciones in vitro (Maddox et al., 2010).

Ante condiciones de estrés aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la planta (Mittler et al., 2004). Es importante señalar que el daño en la planta ocurre cuando la cantidad de ROS es mayor que la capacidad antioxidante (Michalak, 2006). De forma natural, todas las plantas sintetizan una gran cantidad de compuestos orgánicos, entre estos, los metabolitos primarios y secundarios (Baraldi et al., 2017). Los metabolitos secundarios están involucrados en los sistemas de defensa y en procesos de respuestas a estrés biótico y abiótico (Bellaloui, 2012).

Los compuestos fenólicos (CF) son metabolitos secundarios, esenciales durante el crecimiento y reproducción de las plantas, actúan como agentes protectores frente a patógenos (Cervilla et al., 2012). Dentro de la clasificación de los CF se encuentran los ácidos fenólicos (AF), distribuidos en todo el reino vegetal, con propiedades antioxidantes y antimicrobianas (Xu et al., 2008). Los compuestos fenólicos cumplen funciones de defensa en las plantas, ayudan a hacer frente a factores bióticos y abióticos (Lu et al., 2015); tienen una importancia fisiológica y morfológica para las plantas, ya que poseen propiedades como antioxidantes y antimicrobianos (Balasundram et al., 2006). El contenido de sustancias fenólicas presenta una alta correlación con su capacidad antioxidante (Gaviria et al., 2012). Los ácidos gálico y ferúlico se han informado como buenos inhibidores del crecimiento de Botrytis cinérea (Apolonio-Rodríguez et al., 2017). Los ácidos fenólicos reducen, en campo, la incidencia y severidad de C. michiganensis en el cultivo de tomate (Zárate-Martínez et al., 2018).

Los antioxidantes son compuestos que contrarrestan el estrés oxidativo causado por un desequilibrio de especies reactivas de oxígeno (Halliwell, 2006). Estos pueden ser enzimáticos y no enzimáticos. Dentro de los antioxidantes enzimáticos se encuentran: la enzima catalasa que cataliza la dismutación de H2O2 en H2O y O2 (Asada, 1999). Es importante mencionar que todas las plantas tienen una red de defensa muy bien organizada y coordinada, la cual, se debe a señales apropiadas durante la patogénesis (Jones & Dangl, 2006).

Cuando en las plantas hay baja actividad de la enzima catalasa, estas pueden presentar baja tolerancia al estrés, por el contrario, el aumento en la actividad de la catalasa reducirá en las plantas los niveles tóxicos de H2O2 (Vandenabeele et al., 2004). El glutatión peroxidasa pertenece a una familia de enzimas que protege a las células contra el daño oxidativo causado por el exceso de ROS (Wang et al., 2017) y junto a la ascorbato peroxidasa son las principales enzimas que eliminan estas especies y catalizan la reducción de H2O2 con el fin de prevenir el daño celular (Ozyigit et al., 2016). Ascorbato peroxidasa tiene dos formas citosólicas, una con funciones defensivas y otra unida a la membrana, por lo cual, se le conoce como un secuestrador de ROS (Foyer & Noctor, 2005; Pignocchi et al., 2003). Entre los antioxidantes no enzimáticos se encuentran los fenoles y flavonoides (compuestos más comunes en frutas y vegetales), que tienen una fuerte capacidad antioxidante.

El estrés biótico puede inducir el estrés oxidativo en las plantas y activar su sistema de defensa antioxidante, principal mecanismo para la eliminación de ROS (Mittler et al., 2004). El objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar el efecto de los ácidos fenólicos sobre el sistema de defensa antioxidante enzimático y no enzimático en plantas de tomate sometidas a estrés biótico.

Materiales y métodos

Establecimiento del cultivo

El trabajo se realizó de marzo a diciembre de 2016, en un invernadero de mediana tecnología (ventilación natural y sin calefacción) del departamento de Horticultura en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), Saltillo, México (25° 21’ 13’’ latitud norte y 101° 01’ 56’’ longitud oeste, a 1743 msnm).

El 20 de marzo se sembró en charolas de poliestireno de doscientas cavidades, tomate tipo Saladette de la variedad Río Fuego, el 24 de abril se trasplantó en bolsas negras de polietileno, las cuales contenían 10 l de sustrato perlita: peat moss relación 1:1 (v: v). El cultivo se manejó a un solo tallo, se le realizaron podas de yemas axilares y deshoje. La nutrición fue administrada a través de un sistema de riego dirigido con solución Steiner (Steiner, 1961), la que se aplicó a cuatro concentraciones: 25 % en etapa vegetativa, 50 % en floración, 75 % en amarre de frutos, y 100 % en llenado y cosecha de fruto.

Aplicación de tratamientos

Los tratamientos consistieron en la aplicación de ácidos fenólicos (AF), para ello se empleó como fuente el producto Defens Gr® (10 000 ppm de ácidos fenólicos). Se establecieron seis tratamientos: 1) testigo absoluto (T0); 2) aplicación de ácidos fenólicos antes de inocular Cmm (AFA); 3) aplicación de ácidos fenólicos después de inocular Cmm (AFD); 4) aplicación de ácidos fenólicos antes y después de inocular Cmm (AFAD); 5) solo aplicación de ácidos fenólicos (AF) y 6) solo inoculación con Cmm.

Se inició con la aplicación foliar de ácidos fenólicos siete días después del trasplante (ddt). Cada siete días se aplicó una dosis de 1 kg ha-1, para un total de diez aplicaciones, a todos los tratamientos a excepción de AFA, ya que en este tratamiento hubo tres aplicaciones, a una dosis de 3,3 kg ha-1 a intervalos de cinco días.

A los 21 ddt se realizó la inoculación con C. michiganensis subsp. michiganensis, día en el que no se realizó aplicación de AF, restableciendo las aplicaciones a los 28 ddt.

Inoculación de C. michiganensis subsp. michiganensis

Las plantas correspondientes a los tratamientos con estrés biótico se inocularon con C. michiganensis subsp. michiganensis a los 21 ddt, a una concentración de 1x105 UFC ml-1. Se realizaron cortes en las hojas, las cuales, se sumergieron en 30 ml de solución bacteriana por 5 min, el sobrante se asperjó al follaje.

La bacteria C. michiganensis subsp. michiganensis se aisló de plantas de tomate con síntomas atribuibles a esta. Se obtuvo savia de las plantas colectadas mediante un macerado en mortero de porcelana. La savia se sembró en cajas Petri con medio de cultivo NBY (Borboa et al., 2009). Se incubaron a 28 °C por 48 h. El crecimiento bacteriano se purificó, se les realizó pruebas morfológicas y bioquímicas para su identificación. Se realizó un lavado del crecimiento bacteriano y se ajustó a 1x105 UFC ml-1.

Muestreos y variables estudiadas

A los 15, 31 y 92 ddt, se seleccionaron plantas aleatorias, de las cuales se tomó la tercera hoja joven expandida. A los 90 ddt se cortaron frutos seleccionados al azar, frutos uniformes y con el mismo grado de madurez. Las muestras se congelaron a -80 °C, se liofilizaron durante 72 h a -84 °C y 0,060 mbar en un liofilizador (Labconco, modelo FreeZone 2,5 l, Kansas City, MO, USA). Estas muestras se molieron hasta obtener un polvo fino.

Extracto enzimático (EE): en un tubo eppendorf de 2 ml, se colocaron 200 mg de tejido vegetal liofilizado, se adicionaron 20 mg de polivinil pirrolidona y 1,5 ml de buffer de fosfatos pH 7-7,2 (0,1 M), se centrifugó a 12 000 rpm durante 10 min a 4 °C en una microcentrífuga (Labnet Int. Inc., modelo PrismTM R). El sobrenadante se recolectó y filtró con una membrana de PVDF de 0,45 micras de poro (Ramos et al., 2010). Con el EE se determinaron todas las variables evaluadas.

Antioxidantes enzimáticos

Catalasa (CAT) (EC 1.11.1.6): se cuantificó su actividad al medir dos tiempos de reacción, tiempo 0 (T0) y tiempo 1 (T1), por el método espectrofotométrico (Cansev et al., 2011). La reacción se realizó a 20 °C bajo agitación constante, el consumo de H2O2 se leyó a 270 nm en un espectrofotómetro UV-VIS (ÚNICO, modelo 2150, Dayton, USA). La diferencia de las absorbancias se interpoló en la ecuación de la curva de calibración realizada con H2O2 (20 a 200 mM). Los resultados se reportaron como actividad específica (U mg-1 proteínas).

Superóxido dismutasa (SOD) (EC 1.15.1.1): la prueba de superóxido dismutasa se realizó con el kit de Cayman superoxide dismutase assay (CAYMAN CHEMICAL, 2017). En una microplaca se agregó por pocillo: 10 μl de EE, 200 μl del radical detector, 20 μl de xantina oxidasa, se agitó durante 5 s y se cubrió la microplaca para incubar por 30 min a temperatura ambiente (26 ºC), enseguida se determinó la absorbancia en el lector de microplacas (Biotek, modelo ELx808™) a 450 nm. Las absorbancias obtenidas se interpolaron en la ecuación de la curva de calibración realizada con SOD (0,0 a 0,050 U ml-1). Se reportó como actividad específica (U mg-1 proteínas).

Glutatión peroxidasa (GPX) (E.C. 1.11.1.9): se determinó con la metodología propuesta por Flohé & Günzler (1984), modificada por Xue et al. (2001), con H2O2 como sustrato. Se determinaron las absorbancias en un espectrofotómetro UV-VIS (ÚNICO, modelo 2150, Dayton, USA) a 412 nm y estas se interpolaron en la ecuación de la curva de calibración realizada con GSH (0,02 a 1 mM). Se reportó como actividad específica (U mg-1 proteínas).

Ascorbato peroxidasa (APX) (E.C. 1.11.1.11): se midió en dos tiempos T0 (Tiempo inicial) y T1 (Tiempo un minuto de reacción) de acuerdo a Nakano & Asada (1987). Se reportó como actividad específica (U mg-1 proteínas).

Fenilalanina amonio liasa (PAL) (E.C. 4.3.1.5): se determinó de acuerdo con Sykłowska-Baranek et al. (2012). Se determinó absorbancia a 290 nm en un espectrofotómetro UV-VIS (ÚNICO, modelo 2150, Dayton, USA). Las absorbancias se interpolaron en la ecuación obtenida de la curva de calibración con ácido transcinámico (0,01-0,8 mg ml-1). Los resultados se reportaron como actividad específica (U mg-1 proteínas).

Antioxidantes no enzimáticos

Glutatión reducido (GSH): se cuantificó según la metodología establecida por Xue et al. (2001), mediante la reacción con DTNB [ácido 5,5’-ditio-bis (2-nitrobenzoico)]. Se determinaron las absorbancias en un espectrofotómetro UV-VIS (ÚNICO, modelo 2150, Dayton, USA) a 412 nm y estas se interpolaron en la ecuación de la curva de calibración realizada con GSH (0,02 a 1 mM). Los resultados se expresaron en mM de GSH por mg de proteínas totales.

Flavonoides totales: se obtuvieron por el método Dowd, adaptado por Arvouet-Grand et al. (1994). Se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 415 nm en un espectrofotómetro UV-VIS (ÚNICO, modelo 2150, Dayton, USA). El contenido total de flavonoides se determinó con una curva de calibración con quercetina (0 a 50 ppm) en metanol, los resultados se expresaron en miligramos equivalentes de quercetina por 100 gramos de peso seco (mg EQ 100 g-1 PS).

Fenoles totales (FT): se determinaron según la metodología propuesta por Singleton et al. (1999). Se obtuvieron absorbancias en un espectrofotómetro UV-VIS (ÚNICO, modelo 2150, Dayton, USA) a 750 nm; estas se interpolaron en la ecuación obtenida de la curva de calibración con ácido gálico (1-12,5 ppm), los resultados fueron expresados en miligramos equivalentes de ácido gálico por 100 gramos de peso seco (mg EAG 100 g-1 PS).

Capacidad antioxidante

Se determinó la capacidad antioxidante por DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) y ABTS [2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico)]. Para ello, se utilizó la metodología propuesta por Sykłowska-Baranek et al. (2012). Las absorbancias se obtuvieron en el Lector de Microplacas (Biotek, Modelo ELx808™) a 540 nm. La determinación de antioxidantes por ABTS (C18H18N4O6S4) se realizó por el método espectrofotométrico de Miller et al. (1993); se cuantificó la absorbancia en un espectrofotómetro UV-VIS (ÚNICO, modelo 2150, Dayton, USA) a 754 nm. Las absorbancias se interpolaron en las ecuaciones obtenidas de las curvas de calibración realizadas con TROLOX (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico) (C14H18O4) y ácido ascórbico (C6H8O6) con estándares, a una concentración de 0,1 a 5 mM y 0,01 a 0,5 mg ml-1, respectivamente.

Análisis estadístico

El diseño experimental empleado fue completamente al azar con un total de cinco repeticiones. Una planta se consideró como unidad de muestreo y cada repetición se conformó de dos unidades de muestreo. Se realizó un análisis de varianza y una prueba de comparación de medias según la prueba LSD de Fisher (p≤0,05) con el programa estadístico InfoStat (Di-Rienzo et al., 2008).

Resultados

Antioxidantes enzimáticos

A los 15 ddt, se encontró diferencia estadística en la actividad de la catalasa (CAT), el tratamiento AFA presentó la mayor actividad, mientras que los tratamientos AFAD, AF y Cmm, la menor (Cuadro 1). En el segundo muestreo, a los 31 ddt, no hubo diferencias significativas entre los tratamientos. A los 92 ddt hubo diferencias significativas, el tratamiento Cmm fue el que presentó mayor actividad de esta enzima un 264 % más que el T0. En fruto (90 ddt), no hubo diferencias significativas.

Cuadro 1 Actividad de antioxidantes enzimáticos en hojas y frutos de tomate variedad Río Fuego (Solanum lycopersicum Mill.), con aplicaciones de ácidos fenólicos. Laboratorio de biología molecular, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, México, 2016. Table 1. Activity of enzymatic antioxidants in leaves and fruits of tomato variety Río Fuego (Solanum lycopersicum Mill.), with applications of phenolic acids. Molecular Biology Laboratory, Universidad Autonoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, Mexico, 2016. Cuadro 1 Actividad de antioxidantes enzimáticos en hojas y frutos de tomate variedad Río Fuego (Solanum lycopersicum Mill.), con aplicaciones de ácidos fenólicos. Laboratorio de biología molecular, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, México, 2016.

En el primer y segundo muestreo (15 y 31 ddt), los tratamientos no mostraron diferencias significativas en la actividad enzimática específica de la superoxidasa dismutasa (SOD) (Cuadro 1). A los 92 ddt los tratamientos AFD y AFAD presentaron la mayor actividad SOD en un 72,6 y 77,9 % más que el T0. La aplicación de ácidos fenólicos al igual que la inoculación con Cmm incrementó la actividad SOD en hojas, este incremento fue mayor cuando las aplicaciones de AF se hicieron en plantas inoculadas con Cmm, así, el patógeno y los ácidos fenólicos activaron los mecanismos de defensa antioxidante. En frutos (90 ddt), los tratamientos provocaron diferencias estadísticas en la actividad enzimática. La aplicación de AF redujo la actividad de la enzima SOD en un 54 % con respecto al T0; inocular las plantas con Cmm, también redujo la actividad SOD en un 45,1 %, pero cuando las aplicaciones de AF se hicieron a plantas inoculadas con Cmm la actividad SOD aumentó.

A los 15 y 31 ddt no se encontraron diferencias significativas en la actividad de glutatión peroxidasa (GPX) (Cuadro 1). El tratamiento AFD provocó 209,7 % más actividad de glutatión peroxidasa (GPX) que el T0 a los 92 ddt. Lo anterior, posiblemente, se debió a que los ácidos fenólicos se asperjaron a estas plantas después de la inoculación con C. michiganensis, lo cual generó plantas más estresadas. En fruto, la aplicación de ácidos fenólicos redujo la actividad de GPX en los tratamientos AFAD, AFD, AF y AFA en un 29,9, 31,9, 36,4 y 37,8 %, respectivamente, con respecto al T0.

La actividad enzimática de la ascorbato peroxidasa (APX) mostró diferencias significativas en la medición realizada a los 15 ddt (Cuadro 1). Los tratamientos con aplicación de ácidos fenólicos presentaron menor actividad APX en un 67,3 % (AFA) y 71,5 % (AFAD, AF y Cmm) con respecto al T0. Con estos resultados se puede inferir que la actividad de la enzima APX no fue modificada significativamente por Clavibacter michiganensis, ni por aplicaciones de ácidos fenólicos.

La actividad enzimática de la fenilalanina amonio liasa (PAL) determinada en el primer muestreo (15 ddt) no mostró diferencias significativas (Cuadro 1). A los 31 ddt, el tratamiento Cmm provocó la mayor actividad PAL con 288,4 % más que el T0. A los 92 ddt el tratamiento, Cmm presentó 338,4 % más actividad PAL que el T0. En frutos, los tratamientos no provocaron diferencias significativas. En el segundo muestreo (15 ddt) la aplicación de ácidos fenólicos, antes y después de la inoculación con Cmm, redujo la actividad PAL; en el tercer muestreo (92 ddt) la aplicación de ácidos fenólicos antes de la inoculación con Cmm redujo la actividad PAL.

Antioxidantes no enzimáticos

A los 15 y 92 ddt (Cuadro 2) los tratamientos no provocaron diferencias en la concentración de glutatión reducido (GSH) en hojas. A los 31 ddt el tratamiento AF (solo aplicación de ácidos fenólicos) incrementó en un 58,2 % la concentración de la GSH con respecto al T0. En frutos, los tratamientos provocaron diferencias en la concentración de glutatión reducido, los tratamientos AFA y AF provocaron la mayor y la menor concentración, respectivamente.

Cuadro 2 Contenido de antioxidantes no enzimáticos en hojas y frutos de tomate variedad Río Fuego (Solanum lycopersicum Mill.), con aplicaciones de ácidos fenólicos. Laboratorio de biología molecular, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, México, 2016. Table 2. Content of non-enzymatic antioxidants in leaves and fruits of tomato variety Río Fuego (Solanum lycopersicum Mill.), with applications of phenolic acids. Molecular Biology Laboratory, Universidad Autonoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, Mexico, 2016. Cuadro 2 Contenido de antioxidantes no enzimáticos en hojas y frutos de tomate variedad Río Fuego (Solanum lycopersicum Mill.), con aplicaciones de ácidos fenólicos. Laboratorio de biología molecular, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, México, 2016.

A los 15 ddt (Cuadro 2) la aplicación de ácidos fenólicos promovió en las hojas un mayor contenido de flavonoides totales, ya que el tratamiento AFA provocó 18,4 % más concentración de flavonoides que el T0. A los 31 ddt, el tratamiento AFD provocó 33 % más concentración de flavonoides que el T0, sin embargo, este mismo tratamiento a los 92 ddt provocó el menor contenido de flavonoides (39,3 % menos que el tratamiento testigo). En frutos, la aplicación de ácidos fenólicos no provocó cambios en la concentración de flavonoides totales.

A los 15 ddt no se encontraron diferencias significativas en el contenido de fenoles totales (FT) (Cuadro 2). En el segundo muestreo (31 ddt), el T0 fue diferente al tratamiento AFAD, tratamiento que presentó 20 % menos contenido de FT que el T0. A los 92 ddt hubo diferencias significativas entre los tratamientos, AFD y AF presentaron el mayor y menor contenido de FT, respectivamente; el T0 no mostró diferencia estadística con respecto al resto de los tratamientos. En frutos, los tratamientos provocaron diferencias significativas; AFD, Cmm, AF y AFAD, presentaron 37,5, 47,1, 50,5 y 53 %, menos concentración de FT respectivamente con relación al T0.

Capacidad antioxidante

En el primer muestreo (15 ddt), se encontraron diferencias significativas en la capacidad antioxidante ABTS; los tratamientos AFAD, AF, y Cmm presentaron mayor capacidad antioxidante que el tratamiento T0 (Cuadro 3). En muestreos realizados en hoja a los 31 y 92 ddt y en fruto (90 ddt) el T0 no mostró diferencias estadísticas con el resto de los tratamientos, sin embargo, en el segundo muestreo (15 ddt) AFA y AF presentaron mayores valores que AFAD. En el tercer muestreo (92 ddt), Cmm presentó mayor capacidad antioxidante ABTS que AFAD y en el muestreo de frutos (90 ddt), AF presentó mayores valores que AFAD, lo anterior muestra que la menor capacidad antioxidante ABTS se registró en el tratamiento AFAD. En la capacidad antioxidante por DPPH, se observó que en todos los muestreos los tratamientos provocaron diferencias estadísticas (Cuadro 3). A los 15 ddt, la aplicación de ácidos fenólicos aumentó la capacidad antioxidante, lo anterior se observó en el tratamiento AFA, el cual presentó mayor capacidad antioxidante DPPH que el T0. A los 31 ddt AFAD presentó mayor capacidad antioxidante DPPH que los tratamientos AFD y Cmm. En el tercer muestreo (92 ddt), los tratamientos AFD y AFAD presentaron mayor capacidad antioxidante que el T0. En frutos AF y Cmm presentaron mayor capacidad antioxidante que los tratamientos AFD y AFAD, sin embargo, T0 no fue diferente a ningún tratamiento.

Cuadro 3 Capacidad antioxidante determinada por ABTS [2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico)] y DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), en hojas y frutos de tomate variedad Río Fuego (Solanum lycopersicum Mill.), con aplicaciones de ácidos fenólicos. Laboratorio de biología molecular, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, México, 2016. Table 3. Antioxidant capacity determined by ABTS [2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazoline-6-sulfonic acid)]and DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil) in leaves and fruits of tomato variety Río Fuego (Solanum lycopersicum Mill.), with applications of phenolic acids. Molecular Biology Laboratory, Universidad Autonoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, Mexico, 2016. Cuadro 3 Capacidad antioxidante determinada por ABTS [2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico)] y DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), en hojas y frutos de tomate variedad Río Fuego (Solanum lycopersicum Mill.), con aplicaciones de ácidos fenólicos. Laboratorio de biología molecular, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, México, 2016.

Discusión

La mayor actividad de la enzima catalasa se observó en frutos y en el segundo muestreo en las hojas, lo cual se debió al estrés de las plantas ocasionado por la bacteria Gram positiva Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. La enzima SOD proporciona a las plantas protección contra las ROS, especies que se forman ante condiciones de estrés biótico y abiótico (Feng et al., 2015). Lo anterior evidencia el papel de los ácidos fenólicos como señalizadores de estrés, ya que al aplicar AF la actividad SOD en hoja incrementó, no hubo el mismo efecto en frutos. La enzima SOD representa la línea primaria de control del estrés oxidativo (Gill & Tuteja, 2010); transforma el O2 en H2O2 y, las enzimas ascorbato peroxidasa, glutatión peroxidasa y catalasa, lo destoxifica y reduce a H2O (Asada, 2006). El T0 presentó la mayor actividad SOD en fruto y la menor actividad en hoja. Según los datos anteriores, se puede inferir que los ácidos fenólicos funcionan como señalizadores que activan el mecanismo de defensa antioxidante de la planta.

Los tratamientos T0 y Cmm presentaron la mayor actividad GPX en frutos. En hojas la actividad de esta enzima aumentó conforme pasaban los días y, conforme la planta crecía, las ROS también aumentaron, ya que son subproductos normales de varias vías metabólicas en la planta (Navrot et al., 2007). Una mayor concentración de GPX significa una mayor tolerancia contra el estrés, debido a su capacidad de eliminar ROS (Herbette et al., 2011); Por lo anterior, se puede afirmar que la actividad de GPX aumentó bajo condiciones de estrés, tal como lo informó Diao et al. (2014), al evaluar plantas de arroz bajo diferentes tipos de estreses.

APX es una de las principales enzimas que eliminan ROS en cloroplastos y citosol de células vegetales (Asada, 2000; Ozygit et al., 2016). En este trabajo no se encontraron diferencias significativas entre tratamientos por actividad de la enzima APX, por lo tanto, estos resultados no coincidieron con lo informado por Ozyigit et al. (2016), quienes afirmaron que plantas estresadas presentaron mayor concentración de APX, ya que la enzima juega un papel clave al catalizar la conversión de H2O2 en H2O monodeshidroascorbato (Asada, 2000).

La mayor actividad de PAL en el segundo y tercer muestreo en hoja, coincidió con lo reportado por Pérez et al. (2015) quienes evaluaron la enzima PAL bajo condiciones de estrés biótico, también fue similara lo informado por Flores-Torres et al. (2017), quienes afirmaron que la actividad de la enzima PAL aumentó bajo condiciones de estrés por ataque de algún patógeno. Lo anterior se debió a que la enzima PAL se encuentra involucrada en la vía de los fenilpropanoides, que intervienen en la deposición de compuestos fenólicos en las paredes celulares (van-Loon et al., 2006). Incrementos en la actividad PAL permiten suponer que la planta se prepara contra el avance de un patógeno (Pérez et al., 2015).

La alta concentración de GSH en las hojas del tercer muestreo, se debieron a que esta enzima interviene en el crecimiento y desarrollo de las plantas (Dubreuil-Maurizi & Poinssot, 2012). El GSH proporciona las bases para iniciar la señalización de estrés y, una elevada concentración de GSH, se correlaciona con la capacidad de las plantas para resistir el estrés oxidativo, por lo cual, en el tercer muestreo, se asumió que las plantas se encontraron más preparadas ante un estrés (Wang et al., 2004). Los flavonoides son antioxidantes no enzimáticos cuya síntesis y concentración incrementa en plantas que crecen bajo condiciones de estrés (Appel & Hirt, 2004). La importancia de estos compuestos, se debe a que pueden actuar como eliminadores de ROS y dan protección contra las tensiones bióticas y abióticas (Shi et al., 2015). Lo anterior concuerda con lo observado a los 92 ddt, donde la inoculación del patógeno incrementó el contenido de flavonoides, en este mismo muestreo, la aplicación de ácidos fenólicos redujo el contenido de flavonoides en los tratamientos con estrés biótico, prueba de esto se observó en los tratamientos AFAD, AFA y AFD, con 19,3, 33,3 y 48,7 % menos contenido de flavonoides que el tratamiento Cmm. Esta reducción se debió a que algunos ácidos fenólicos actúan como toxinas contra ciertos patógenos, reducen el nivel de estrés en la planta y, como consecuencia, la concentración de flavonoides (Maham et al., 2018).

En este estudio no se observó una tendencia en la concentración de compuestos fenólicos en las diferentes fechas de muestreo, lo cual se debió a que los niveles de los compuestos fenólicos en la planta dependen más de factores externos que de los mismos tratamientos, tal como lo mencionaron Márguez-García et al. (2009), que los niveles de los compuestos fenólicos en las plantas, dependen del momento de muestreo y de las condiciones del ambiente. Diversos autores reportan que los compuestos fenólicos se encuentran asociados al sistema de protección antioxidante, ya que hay un incremento en la producción y contenido de estos compuestos ante factores de estrés biótico y abiótico (Treutter, 2008).

En las hojas se encontró mayor actividad antioxidante que en los frutos, debido a que en las hojas hay un mayor número de cloroplastos, en los cuales se realiza la fotosíntesis, proceso que genera ROS (Blanke & Lenz, 1989). La actividad antioxidante se correlaciona con el contenido de compuestos fenólicos, tal como lo reportaron Edet et al. (2015), que los valores de antioxidantes en frutos (Hidrofílicos) se correlacionaron significativamente con el contenido de flavonoides, compuestos fenólicos y ácido ascórbico. Con esta información se puede inferir que los compuestos fenólicos son los principales responsables de la actividad antioxidante.

Conclusiones

La inoculación de las plantas de tomate con Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, incrementó la actividad de las enzimas fenilalanina amonio liasa (PAL) y catalasa (CAT) en el tercer muestreo (92 ddt); lo anterior indica que se activó el sistema de defensa antioxidante enzimático por efecto del estrés biótico, mientras que al aplicar ácidos fenólicos a estas plantas la actividad de las enzimas PAL y CAT disminuyó en las hojas.

Al inocular la bacteria Gram positiva C. michiganensis subsp. michiganensis en los frutos de tomate, hubo reducción de la actividad enzimática del superóxido dismutasa y en el contenido de fenoles totales. La aplicación de ácidos fenólicos no intervino en estas concentraciones, solo cuando se realizó de manera preventiva, con el tratamiento de ácidos fenólicos antes de inocular Clavibacter. Lo anterior indica que los ácidos fenólicos intervinieron en los mecanismos de defensa enzimáticos de la planta y redujeron los niveles de estrés ocasionados por la inoculación de C. michiganensis.